Возможности повышения эффективности противовирусной терапии и профилактики ОРВИ. Новые экспериментальные данные на клеточных культурах

Читайте в новом номере

Импакт фактор - 0,584*

*пятилетний ИФ по данным РИНЦ

Регулярные выпуски «РМЖ» №18 от 30.08.2011 стр. 1151
Рубрика: Болезни дыхательных путей

Для цитирования: Еропкин М.Ю., Брязжикова Т.С., Еропкина Е.М. Возможности повышения эффективности противовирусной терапии и профилактики ОРВИ. Новые экспериментальные данные на клеточных культурах // РМЖ. 2011. №18. С. 1151

Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) являются наиболее массовыми заболеваниями, на их долю приходится до 90% всей инфекционной патологии. Наибольшую эпидемическую значимость представляют вирусы гриппа А и B. Тем не менее возбудители, относящиеся к различным семействам, отличающиеся по морфологии и генетической характеристике, но вызывающие сходные по клинической картине заболевания, вносят ощутимый вклад в общую картину респираторных инфекций, обеспечивая стабильный уровень заболеваемости в межэпидемический по гриппу сезон. При этом в качестве этиологических агентов наиболее часто имеют место вирусы парагриппа, респираторно–синцитиальный вирус, адено– и коронавирусы. Ретроспек­тивный анализ и современные данные показывают, что эта тенденция в общих чертах сохраняется в разные годы и на различных территориях (рис. 1) [1– 3].

 В структуре острых инфекций дыхательных путей вирусы парагриппа составляют около 20% у взрослого населения и 30–40% у детей раннего возраста, уступая по частоте только респираторно–синцитиальному вирусу в качестве этиологического фактора поражений нижнего отдела дыхательного тракта [1]. Вирусы парагриппа относятся к группе РНК–содержащих парамиксовирусов размерами 100–300 нм. В настоящее время известны 4 типа вирусов парагриппа, выделенных от человека. Им не свойственна, как вирусам гриппа, вариабельность антигенной структуры. У большинства больных парагрипп протекает как кратковременное заболевание (не более 3–6 дней) без выраженной общей интоксикации. Однако заболевания могут протекать в форме крупа, бронхиолитов и пневмонии. 1–й и 2–й типы парагриппа чаще всего ассоциируются с крупом, тогда как наиболее патогенный вирус парагриппа 3–го типа чаще других типов парагриппа обусловливает бронхиты, бронхиолиты, пневмонии. Особенно уязвимы для парагриппа дети 1–го года жизни. В связи с этим необходимо отметить роль парагриппозной инфекции в смертности детей раннего возраста и иммуносупрессивных взрослых пациентов, поскольку, осложняясь бактериальной инфекцией, она является причиной смертности от инфекций нижних дыхательных путей в 25–30% случаев в этих группах. Реинфекция парагриппа возможна на протяжении всей жизни, приобретая особое значение у иммуносупрессивных пациентов, расширяет этот круг неблагополучная экология, стрессовые условия жизни мегаполисов.
 Респираторно–синцитиальный вирус, также относящийся к семейству РНК–содержащих парамиксовирусов, является важным патогеном инфекций нижних дыхательных путей младенцев. Отмечается, что от 80 до 90% всех младенцев пережили по крайне мере один эпизод РС–вирусной инфекции, от 0,5 до 2% прошли лечение в больнице [4]. По наблюдениям этих авторов, у 30% взрослых, перенесших в детстве РС–вирусную инфекцию, развивалась бронхиальная астма по сравнению с 3,8% в контрольной группе.
 Аденовирусы и коронавирусы, являясь непременными участниками эпидемического процесса, в структуре ОРВИ составляют до 50 и до 20% соответственно [5]. Аденовирусы – ДНК–содержащие, безоболочечные вирусы диаметром до 80 нм – насчитывают более 50 серотипов, которые отличаются по эпидемиологическим особенностям и тропности к различным тканям. Поэтому спектр вызываемых ими поражений достаточно широк: воспалительные заболевания носоглотки, конъюнктивы, мочевого пузыря и желудочно–кишечного тракта. Отме­чается, что при острых кишечных инфекциях у детей аденовирусы выделяются с частотой до 7,5% [6]. Мы остановили свой выбор на аденовирусе 3–го серотипа ввиду его большого эпидемического значения как возбудителя назофарингеальной лихорадки. Что касается коронавирусов,− РНК–содержащих вирусов, имеющих в составе вириона липопротеиновую оболочку и размер около 120 нм, они так же, как аденовирусы, помимо эпителия дыхательных путей имеют тропность к эпителию желудочно–кишечного тракта. Особенно уязвимы к коронавирусной инфекции дети младшего возраста, у которых катаральные явления в преобладающем большинстве случаев сочетаются с диарейным синдромом [5].
В отношении респираторных вирусных инфекций следует отметить, что антивирусная терапия актуальна в группах повышенного риска и при тяжелом течении заболевания. Так, рибавирин назначается пациентам с факторами риска и тяжелом течении РС–вирусной инфекции [1]. В остальных случаях терапия острых респираторных вирусных инфекций направлена главным образом на основные звенья патогенеза. Поиск средств, которые при минимальных побочных эффектах облегчали бы течение заболевания и сокращали его сроки, является актуальной задачей. Не менее актуальной проблемой применения этиотропных препаратов является быстрое появление и селекция устойчивых к ним штаммов. Так, ремантадин, кроме того, что он неэффективен против гриппа В, в последние эпидсезоны не действовал на значительную часть вирусов подтипа А(Н3N2). Сезонные вирусы подтипа А(Н1N1), напротив, были в большинстве чувствительны к ремантадину, но быстрыми темпами приобретали устойчивость к озельтамивиру [7]. Пандемический штамм 2009 г. A(H1N1)pdm чувствителен к озельтамивиру и устойчив к ремантадину [8]. Все это является основанием для поиска препаратов,  не направленных на вирус как таковой или его взаимодействие с клеткой, а стимулирующих клеточную резистентность, выработку интерферонов, иммунную защиту. Вследствие этого остается актуальным использование неспецифических препаратов против ОРВИ, включая растительные и гомеопатические препараты.
Одним из таких препаратов является Инфлюцид («Дойче Хомеопати–Унион»), имеющий следующий состав: 100 г раствора содержит Aconitum D3 10g, Gelsemium D3 10g, Ipecacuanha D3 10g, Phophorus D5 10g, Bryonia D2 10g, Eupatonum perfoliatum D1 10g. Прочие ингредиенты: Eucalyptus globules, 96% этанол, вода очищенная. Содержание алкоголя 45 об.%. Выпускается как представленная выше жидкая, так и таблетированная форма препарата. По данным литературы, Инфлюцид существенно снижает такие симптомы, присущие всем ОРЗ, как гипертермия, боли в конечностях, кашель, гиперемия слизистых, воспалительные процессы в глотке и гортани [9]. In vitro показано стимулирующее действие препарата на продукцию клетками интерферона [10].
Ранее нами продемонстрировано противовирусное действие Инфлюцида in vitro в отношении целого ряда актуальных штаммов гриппа – сезонных штаммов А(H1N1) и пандемического штамма 2009 г. – A(H1N1)pdm, A(H3N2), A(H5N1) и В, а также вирусов герпеса человека 1–го и 2–го типов и аденовируса III типа [11–13]. Препарат не только снижал продукцию вирусных частиц при оценке методом реакции гемагглютинации (РГА), но и увеличивал резистентность клеток в культуре к цитопатогенному действию вирусов при оценке клеточной жизнеспособности и дыхательного метаболизма методом МТТ [12,13]. Кроме того, показано достоверное снижение смертности мышей, зараженных летальной дозой вируса гриппа А/PR/8/34, при лечебно–профилактическом введении клинически адекватных доз Инфлюцида [11].
Задачей настоящей работы было сравнительное исследование in vitro действия Инфлюцида в отношении эталонных штаммов парагриппа, корона– и РС–вирусов, а также возможного цитопротекторного действия препарата в отношении токсичности, вызванной высокими концентрациями распространенных противовирусных препаратов ремантадина и арбидола. В работе использованы эталонные штаммы вирусов, полученные из Музея вирусов ОРЗ ФГБУ НИИ гриппа Минздрав­соцразвития: HPIV–3/2235, HCoV–lp/3482, RSV/4317, а также HSV1/SPb/248/88 и HSV2/etalon/2000. В качестве культур клеток использованы А–549 (эпителиодная линия, происходящая от карциномы легкого человека) и L–41 (макрофагальная линия человека моноцитар­но–лейкемического происхождения).
Цитопатогенное действие вирусов учитывалось в инвертированном микроскопе. Вторым важным индикатором защитного действия препарата служила реакция восстановления клетками в культуре тетразолиевого красителя МТТ (Тиазолила голубого), интенсивность которой отражает степень жизнеспособности клеток в результате восстановления красителя митохондриальными и частично цитоплазматическими дегидрогеназами. Тест часто используется в вирусологии для оценки цитопатогенного действия вирусов на клетку [14]. Его результаты можно интерпретировать как степень устойчивости клеток к действию вирусов. Микротетразолиевый тест также широко используется в оценке воздействия на клетки токсикантов, фармакологических препаратов, неблагоприятных факторов окружающей среды [15], поэтому одновременно с противовирусным эффектом можно оценивать токсичность исследуемых препаратов in vitro. Инфлюцид вводили в среду культивирования клеток за 6–24 ч до заражения вирусом («профилактическая» схема введения) и одновременно с заражением вирусом («лечебно–профилактическая» схема введения) в разведении на буфере PBS 0,125–0,5% (концентрация в среде исходного жидкого препарата).
Результаты исследования
Противовирусное действие различных концентраций Инфлюцида в отношении аденовируса III типа при вирусной нагрузке 10 тканевых инфекционных доз представлено на рисунке 2. В качестве критерия жизнеспособности клеток в культуре показана оптическая плотность в МТТ–тесте. Как видно из рисунка 2, существует оптимальная концентрация, при которой действие препарата наиболее эффективно. Для дальнейших исследований нами была выбрана минимальная из эффективных концентраций препарата – 0,125%.
Противовирусное действие Инфлюцида в отношении исследованных вирусов ОРВИ при лечебно–профилактическом введении показано на рисунке 3. В качестве критерия эффективности представлена разница логарифма титра вируса в контроле (без препарата) и опыте – ΔlogТИД50. Как правило, в вирусологических исследованиях ΔlogТИД50≥2,0 считается удовлетворительным противовирусным эффектом. Таким образом, препарат оказался эффективным против всех исследованных вирусов.
Как и следовало ожидать, в случае предынкубации клеточных культур с Инфлюцидом и последующего заражения соответствующими вирусами защитный эффект препарата оказался еще более выраженным (рис. 4). Разница титра вируса с контролем для большинства исследованных вирусов превышает 2,5 и даже 3, что может считаться для препарата широкого спектра действия очень хорошим результатом. На рисунке 4 мы не случайно представили данные не только по ОРВИ, но и по вирусам герпеса. В свете показанного ранее стимулирующего действия препарата на продукцию клетками интерферона [10] представляет большой интерес высокая эффективность Инфлюцида против вируса герпеса II типа, поскольку инфекция последним связана с иммунодефицитными состояниями: заболевание, обусловленное вирусом простого герпеса, в клинической практике встречается как инфекция, осложняющая иммунодефицитные состояния различной этиологии, так и в качестве самостоятельного заболевания, которое расценивается как вторичный иммунодефицит. Много­чис­лен­ными исследованиями доказано, что вирус герпеса II типа вызывает значительно более выраженные и разносторонние иммунологические нарушения сравнительно с вирусом I типа, обусловливая частые рецидивы, зачастую резистентные к проводимой этиотропной терапии [16].
Следующая часть нашей работы была посвящена возможному защитному действию Инфлюцида в отношении токсического ответа клеток в культуре на высокие дозы противовирусных препаратов ремантадина и арбидола. Предпосылкой данного исследования послужило то, что противовирусное действие Инфлюцида in vitro: 1) является неспецифическим; 2) в качестве основного механизма имеет цитопротекторное действие, т.е. защиту клеток от цитопатического воздействия вируса. На рисунке 5 показаны 96–луночные планшеты (культуры L–41 и А–549) при воздействии убывающих концентраций ремантадина с раститровкой 1:1,4 (верхние 4 ряда) и тех же концентраций ремантадина в присутствии Инфлюцида (0,125%). Инфлюцид вносили по «профилактической» схеме. Окраска – методом МТТ. Как видно на рисунке 5, при пограничных концентрациях ре­мантади­на, уже достаточно токсичных, но еще не убивающих все клетки, очевиден защитный эффект Инфлюцида. Это подтверждается количественной обработкой данных спектрофотометрии планшет на анализаторе Vario­scan при характеристической длине волны 550 нм (рис. 6) – практически при всех токсичных концентрациях реман­тадина наблюдался достоверный защитный эффект Инфлюцида.
Аналогично Инфлюцид действует in vitro против токсичности, вызванной современным противогриппозным препаратом арбидолом (рис. 7 и 8). Следует подчеркнуть, что как ремантадин, так и Арбидол брали в этом исследовании в заведомо завышенных концентрациях по сравнению с их терапевтическими дозами. Однако важным следствием обнаруженного эффекта является возможность сочетанного применения Инфлюцида с этими препаратами при ОРВИ, причем их дозы могут при этом быть увеличены без риска возникновения побочных эффектов.

Выводы
1. Инфлюцид обладает in vitro противовирусной активностью в отношении широкого спектра вирусов, вызывающих ОРВИ: аденовирусов, коронавирусов, респираторно–синцитиальных вирусов и вирусов парагриппа. Препарат оказался особенно эффективен при профилактическом введении за 6–24 ч до заражения клеток.
2. Большой интерес в свете показанного ранее интерферон–стимулирующего действия Инфлюцида пред­ставляет высокая эффективность препарата in vitro против вирусов простого герпеса, особенно 2–го типа, связанных с развитием вторичных иммунодефицитов.
3. Кроме противовирусного эффекта Инфлюцид обладает общим цитопротекторным действием, защищая клетки в культуре от токсического воздействия высоких концентраций противовирусных препаратов ре­мантадина и арбидола.

Рис. 1. Этиологическое распределение ОРВИ в России в эпидемический сезон 2010–2011 гг., по данным Федерального Центра по гриппу (НИИ гриппа) [2]. Все типы гриппа – 29,1%, все ОРВИ, кроме гриппа – 70,1%
Рис. 2. Противовирусное действие Инфлюцида на аденовирус 3–го типа в культуре L–41. Вирусная нагрузка 10 ТИД50
Рис. 3. Действие Инфлюцида (0,125%) в отношении вирусов ОРВИ при одновременном внесении в культуру препарата и вируса («лечебно–профилактическое»)
Рис. 4. Действие Инфлюцида (0,125%) в отношении вирусов ОРВИ и герпеса при внесении в культуру за 6 ч до заражения клеток («профилактическое»)
Рис. 5. Защитное действие Инфлюцида (0,125%) в отношении токсичности, вызванной высокими концентрациями ремантадина в культуре клеток L–41. Тест–метод – МТТ, внешний вид планшет
Рис. 6. Защитное действие Инфлюцида (0,125%) в отношении токсичности, вызванной высокими концентрациями ремантадина в культуре клеток L–41, данные фотометрии
Рис. 7. Защитное действие Инфлюцида (0,125%) в отношении токсичности, вызванной высокими дозами арбидола в культуре клеток А–549. Тест–метод – МТТ, внешний вид планшет
Рис. 8. Защитное действие Инфлюцида (0,125%) в отношении токсичности, вызванной высокими дозами арбидола в культуре клеток А–549, данные фотометрии

Литература
1. Subhash Chandra Parija http://emedicine.medscape.com/article/224708–overview/Updated:Apr 19, 2010.
2. www.influenza.spb.ru
3. Голованова А.К., Ревунова О.В., Цыбалова Л.М. и др. Этиологическая структура респираторных вирусов в Санкт–Петербурге и Ленинградской области по результатам их изоляции в 1997–2000 г.г. // В сб.: Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций. СПб., апрель 2001, С.16–18.
4. Ruotsalainen М. et al. Respiratory morbidity in adulthood after respiratory syncytial virus hospitalization in infancy. // Pediatr. Infect Dis. J. – 2010. – V. 29(9). – P. 872–974.
5. Смирнов В.С. Современные средства профилактики и лечения гриппа и ОРВИ. –СПб., «ФАРМиндекс» – 2003. – 50С.
6. Козина Г.А. Клинико–эпидемиологические особенности и вопросы терапии острых кишечных инфекций аденовирусной этиологии F 40/41 у детей. / Автореф. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук. М., 2010г.
7. Еропкин М.Ю., Грудинин М.П., Коновалова Н.И. и др. Антигенные и генетические особенности современных вирусов гриппа в России // Материалы I Всероссийского Ежегодного Конгресса по инфекционным болезням. М., 30 марта–01 апреля, 2009. – С. 67.
8. Киселев О.И., Комиссаров А.Б., Стукова М.А. и др. Пандемический грипп 2009 г. в России. Диагностика и молекулярно–биологические характеристики вируса // Вопр. вирусологии. – 2011. – Т. 56. – № 1. – С. 17–21.
9. Гаращенко Т.И., Гаращенко М.В., Мезенцева М.В. Клинико–иммунологическое обоснование гомеопатических препаратов в профилактике и лечении гриппа и ОРВИ // Русский медицинский журнал.–2005.–Т.13.–№13.–С.1432–1437.
10. Ершов Ф.И. Рациональная фармакотерапия гриппа и ОРВИ // Фарм. вестник. – 2003. – № 33(312).
11. Еропкин М.Ю., Григорьева В.А., Гудкова Т.М. и др. Активность препарата «Инфлюцид» в отношении вирусов гриппа в модельных системах // МЕДЛАЙН–Экспресс. – 2007. – № 6. – С.23–26.
12. Еропкин М.Ю., Коновалова Н.И., Григорьева В.А., Байбус Д.М., Гудкова Т.М. Действие препарата Инфлюцид in vitro против пандемического штамма 2009 г. A(H1N1) «свиного» («мексиканского») гриппа // Традиционная медицина – 2009. – № 3(18). – С. 14–18.
13. Еропкин М.Ю., Гудкова Т.М., Даниленко Д.М. и др. Пандемический грипп 2009 г. в России: антигенные, биологические свойства и чувствительность к противовирусным препаратам // Русский медицинский ж. – 2010. – Т. 18, № 7. – С.410–415.
14. Watanabe W., Konno K., Ijichi K., et al. MTT colorimetric assay system for the screening of anti–orthomyxo– and anti–paramyxoviral agents // J. Virol. Methods. 1994. Vol. 48 No.2–3 P. 257–265.
15. Borenfreund Е, Babich H, Martin–Alguacil N. Comparison of two in vitro cytotoxicity assays – the neutral red (NR) and tetrazolium (MTT) tests // Toxicol. In Vitro. – 1988. Vol. 2 No. 1. P. 1–6.
16. Брязжикова Т.С. Герпетическая инфекция: профилактика и лечение // Врач. – 2004. – №2. – С.47–48.


Оцените статью


Поделитесь статьей в социальных сетях

Порекомендуйте статью вашим коллегам

Предыдущая статья
Следующая статья

Авторизируйтесь или зарегистрируйтесь на сайте для того чтобы оставить комментарий.

зарегистрироваться авторизоваться
Наши партнеры
Boehringer
Jonson&Jonson
Verteks
Valeant
Teva
Takeda
Soteks
Shtada
Servier
Sanofi
Sandoz
Pharmstandart
Pfizer
 OTC Pharm
Lilly
KRKA
Ipsen
Gerofarm
Gedeon Rihter
Farmak