Мы провели морфологический анализ 21 образца биопсийного материала кожи век и боковой поверхности лица у пациентов в возрасте 48–56 лет после хирургических операций. Гистологическое исследование биопсийного материала позволяет отметить, что инволюционные изменения кожи затрагивают все ее отделы, включая производные, при этом направленность изменений носит общий характер:
• очаговые дистрофические и деструктивные изменения клеток эпидермиса,
• граница между эпидермисом и дермой имеет вид практически ровной полосы, проявляются участки сгущения грубых, фрагментированных эластических волокон (эластоз). Количество клеток в дерме резко сокращено, при этом теряется их разнообразие.
Преобладающими среди клеток дермы являются фибробласты, популяция которых представлена как функционально активными, иногда гигантскими формами, так и клетками со сниженной синтетической активностью, часто встречаются клетки с деструктивными изменениями и фибробласты, содержащие липофусцин и жир.
Для того чтобы остановить процессы старения и запустить программу ревитализации кожи, необходимо «активизировать» фибробласты, оживить их функцию. Поэтому применение клеточных технологий для коррекции возрастных изменений тканей лица, введение в дерму собственных (аутологичных) или более юных (аллогенных) фибробластов является перспективным направлением в эстетической медицине.
С 2004 года в РГМУ в рамках Российской межотраслевой программы «Клеточные технологии – медицине» изучается возможность использования клеточных культур фибробластов для коррекции возрастных изменений кожи лица при старении и регенерации ран.
По данным зарубежной литературы, методика интрадермального введения культуры аутологичных фибробластов человека используется с 1994 г. американской компанией «Isolagen Technologies Inc.» В опытах на животных было доказано отсутствие онкогенных свойств аутологичных фибробластов. При использовании данного метода аутологичные фибробласты, полученные из кожи доноров, вводятся пациенту сразу после их получения. Были проведены многоцентровые двойные слепые плацебо–контролируемые клинические испытания, доказавшие эффективность и безопасность метода. Эффективность доказывалась значительным уменьшением рельефности кожи (измерялась методом лазерной профилометрии), утолщением дермального слоя, увеличением в нем числа фибробластов и плотности коллагена, а также субъективной оценкой пациентов.
В России правовое законодательство, регламентирующее работу с клеточными технологиями, только разрабатывается. В 2001 г. приказом МЗ РФ создан Экспертный совет по рассмотрению научных исследований в области развития клеточных технологий и внедрению их в практическое здравоохранение. Все исследования в РГМУ, начиная с получения материала и заканчивая непосредственным проведением клеточной трансплантации, проводятся с соблюдением существующих правовых, юридических и этических норм Российской Федерации, а также других нормативных документов и рекомендаций, касающихся этой области медицины.
Так как возрастной процесс снижения тургора и эластичности кожи связан с уменьшением числа юных и зрелых фибробластов, использование клеточных препаратов на основе аутологичных фибробластов или более «юных» фибробластов пуповины позволяет затормозить старение кожи.
Основной принцип омоложения кожи фибробластами заключается в простой идее: доставить в стареющую кожу более эффективные молодые клетки, которые способны выполнять специализированную функцию по синтезу коллагена и гликозаминогликанов. Однако недостатком введения аутологичных фибробластов является невысокий пролиферативный потенциал, особенно у культуры, выделенной из кожи пожилых доноров. С этой точки зрения для достижения оптимального ревитализирующего эффекта необходимо использование «молодых» клеток, поэтому в нашем исследовании для коррекции возрастных изменений кожи лица в лаборатории РГМУ были разработаны две клеточные культуры:
• Суспензия аутологичных фибробластоподобных клеток человека, полученных из кожи пациента.
• Суспензия фибробластоподобных клеток пуповины человека, полученных из пуповины человека после нормальных родов на 39–40–й неделе гестации.
Первым необходимым этапом в работе с клеточной культурой является максимально полное ее описание по известным клеточным цитофенотипам, что позволяет прогнозировать возможности ее клинического использования, терапевтические эффекты и возможные осложнения трансплантации. Основная масса клеток культур, полученных из кожи человека и пуповины человека, имела фибробластоподобную морфологию (рис. 1–3).
Значительная часть популяции клеток пуповины экспрессировала коллагены І и ІІ типов, что позволяет прогнозировать хороший ревитализирующий эффект на дерму при их трансплантации. Было обнаружено, что, помимо вышеперечисленных маркеров, фибробластоподобные клетки пуповины выделяли широкий спектр ангиогенных факторов, что позволяет прогнозировать стимуляцию микроангеогенеза при их транстплантации в ткани.
Для обеспечения безопасности пациентов в РГМУ разработаны стандартные методы выделения, наращивания и транспортировки клеточного материала, проводится контроль качества культуры.
Перед забором биологического материала обязательно тестируется кровь донора на наличие маркеров следующих инфекционных агентов: вирусов гепатита В и С; вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 и 2 типов; вируса герпеса простого 1, 2 и 6 типов; вируса Эпштейна–Барра; цитомегаловируса и Toxoplasma Gondi; сифилиса. При заборе пуповины дополнительно к вышеперечисленным анализам матерям проводится исследование соскоба из цервикального канала на наличие маркеров уреоплазмы, хламидии и микоплазмы. Выявление этих инфекций является абсолютным противопоказанием для культивирования биологического материала и введения полученных клеток реципиенту.
Конечно, полное представление о безопасности и эффективности использования клеточной культуры можно получить лишь в результате клинических исследований, поэтому клеточные культуры, разработанные в рамках межотраслевой программы «Новые клеточные технологии – медицине» в настоящем исследовании, прошли строгую паспортизацию и оценку: проведены экспериментальные исследования и оценена их безопасность на животных, оценена безопасность и эффективность на 1 и 2 этапе клинических исследований.
На доклиническом этапе исследования доказана нетоксичность и апирогенность клеточных культур, отсутствие их иммуногенности и онкогенности. На первом этапе клинических исследований на 30 добровольцах оценена безопасность введения клеточных культур. На втором этапе многоцентрового исследования изучалась эффективность клеточной терапии. В исследование включены 118 женщин в возрасте 30–65 лет, 80 из них интрадермально (методика мезотерапии) вводилась культура фибробластоподобных клеток пуповины человека в дозе от 2 до 5 млн. на 5,0 мл.NCTF от 1 до 3–х раз, 38 – культура аутологичных фибробластов в дозе от 2 до 5 млн. на 5,0 мл. NCTF от 1 до 3–х раз Контрольную группу составили 30 женщин в возрасте 30–65 лет, которым вводился р–р NCTF или витаминные коктейли по той же методике.
Оценка эффективности интрадермального введения клеточной культуры проводилась с использованием современных инструментальных методов оценки кожи: эластометрия, лазерная доплеровская флоуметрия, профилометрия, УЗИ исследование. Результаты оценивались до введения клеточной культуры и через 14 дней, 1, 3 и 8–12 месяцев от проведения первой процедуры. Для более достоверной оценки эффективности у 10 пациенток в основной и 10 в контрольной группе проводилась гистологическая оценка регенерации кожи на 28–е суки после введения.
После введения клеточной культуры фибробластоподобных клеток пуповины человека и аутологичных фибробластов отмечено повышение показателей эластичности, микроциркуляции кожи, увеличение толщины и шероховатости кожи. Клинический эффект от введения культуры клеток начинал проявляться со вторых–третьих суток от первой иньекции и постепенно нарастал, достигая стойкого результата на протяжении, как минимум, 8–12 месяцев, что согласуется с данными зарубежной литературы.
Количественная оценка рельефа кожи проводилась методом профилометрии. При анализе полученных данных выявлены достоверные различия (p<0,05) средних величин параметров шероховатости в трех областях лица до и после проведения мезотерапии с использованием клеточного материала, что свидетельствует об изменении микрорельефа кожи в сторону увеличения высоты треугольных и ромбических полей, которое связано с ростом клеточных элементов эпидермиса (рис. 4). Наибольшие изменения (20,5%) отмечены в параорбитальной области.
Сравнительный анализ показателей эластичности кожи в разные сроки после ведения клеточной культуры представлен на рисунке 5. Эластичность кожи после введения клеточного материала повышалась на 15–26%. Эффект от проведения курса мезотерапии сохранялся в течение 8–12 месяцев (рис. 6).
Клинический эффект зависел от возраста, степени инвалюционных изменений и типа кожи обследуемых. Отличный и хороший эффект уже после первой процедуры отмечен у 91% пациенток в группе от 30 до 40 лет.
В возрастной подгруппе от 40 до 50 лет хороший и отличный эффект после первой процедуры отмечен у 69% пациенток. У 15 (31%) из них с сухим (атрофичным) типом кожи эффект был слабым, что потребовало увеличения дозы клеточной культуры до 5,0х106 в 5 мл при повторном введении через 1 месяц. У пациенток в группе старше 50 лет инволюционные изменения кожи наиболее выражены, поэтому отличный и хороший эффект от первой процедуры получен лишь в 57% наблюдений. Надо отметить, что эффект от клеточной терапии нарастал через 1–3 месяца после первой иньекции у 88 % пациенток – это может быть связано со стимуляцией собственных фибробластов дермы.
При сравнении результатов использования собственных (аутологичных) фибробластов и фибробластов пуповины у пациентов старшей возрастной группы мы отметили, что более выраженный эффект получен при использовании фибробластов пуповины (рис. 7)
У 86% пациенток, получавших в качестве клеточного препарата для мезотерапии аллогенные фибробласты пуповины, был отмечен хороший клинический эффект уже через 14 дней после первой процедуры. При использовании аутологичных фибробластов хороший эффект после первой процедуры получен лишь у 7 (58%) пациенток.
При гистологическом исследовании биопсийного материла через 28 дней после проведения мезотерапии было отмечено увеличение количества функционально активных и юных фибробластов в основной группе по сравнению с контролем. Электронно–микроскопическое исследование показало, что в участках ткани имеются коллагеновые фибриллы различного диаметра, самые тонкие располагаются в непосредственной близости к клеточной мембране фибробластов, что указывает на продолжающийся рост и незаконченность процесса фибриллогенеза. (рис. 8.)
При обратной пересадке в кожу пациента фибробласты заселяют дерму и активно синтезируют весь комплекс компонентов внеклеточного окружения и коллаген, столь необходимых для поддержания кожи в оптимальном физиологическом состоянии.
Заключение
Использование клеточной культуры фибробластов из пуповины человека или аутологичных фибробластов, выделенных из кожи человека при проведении мезотерапии, безопасно и эффективно. Способствует ревитализации кожи за счет стимуляции собственных фибробластов к синтезу коллагена и гликозаминогликанов, характеризуется быстрым наступлением клинического эффекта и его длительностью от 8 до 12 месяцев. Положительный эффект выражается в улучшении качеств кожи: повышении ее эластичности и увеличении регенераторных способностей.
