Механизм повреждающего действия CCl4 основан на образовании в эндоплазматическом ретикулуме активных радикалов, которые формируются при его расщеплении цитохромом Р450 [3]. CCl4 вызывает центролобулярные повреждения, переходящие в фиброз и центролобулярный цирроз. Фиброз является конечным результатом хронических воспалительных процессов, вызванных различными патологическими стимулами [4] в результате активации звездчатых клеток, которая стимулируется при гибели паренхиматозных клеток [5].
Препаратами, которые могут предупреждать и корректировать функциональные и структурные нарушения печени вне зависимости от этиологических факторов, являются препараты под общим названием «гепатопротекторы» [6, 7]. Одним из широко используемых препаратов является силимарин, который в экспериментальных исследованиях обнаруживает гепатозащитные и антифибротические свойства, что было найдено при использовании таких моделей, как перевязка желчного протока [8], введение этанола [9], CCl4 [10]. Важным представляется изучение механизмов повреждения печени, формирования фиброза печени и возможной корректировки патологического процесса под воздействием гепатопротектора силимарина. Цель работы – изучение формирования фиброза печени в динамике под воздействием CCl4 с исследованием морфологических изменений в печени и некоторых маркеров фиброгенеза в сыворотке крови и возможности их изменения под воздействием силимарина.
Материал и методы
Исследования проводились на белых крысах-самцах породы Wistar массой 250–350 г. Крысы содержались на стандартном рационе и получали корм и воду ad libitum. Оценка состояния животных проводилась путем ежедневного осмотра и определения основных параметров жизнедеятельности. Исследовались признаки общего угнетения, подвижность, состояние шерсти, видимых слизистых оболочек, поведение, двигательная активность. Один раз в неделю проводилось взвешивание животных, оценивалось потребление пищи и воды.
Исследования проведены на 4-х группах животных по 5 в группе. Токсическое поражение печени моделировали путем подкожного введения CCl4 (50% раствор в оливковом масле в дозе 0,2 мл / 100 г массы тела) 2 р./нед. Забой животных проводился на сроках 14, 30 и 90 сут от начала введения CCl4. При забое проводилось взятие крови. силимарин вводился внутрижелудочно в дозе 15 мг/кг 5 р./нед.
Гистологическое исследование. Ткань печени фиксировалась в 10% растворе формалина, проводились обезвоживание и заключение образцов в парафин. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином (по Ван Гизону). Оценка степени фиброзирования ткани проводилась по системе METAVIR.
В сыворотке крови измеряли уровни фактора некроза опухоли-α (TNF-α), трансформирующего фактора роста-β (TGF-β), интерлейкина-10 (IL-10), коллагена IV, гиалуроновой кислоты иммуноферментным методом.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica 8. Достоверность различий оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна – Уитни.
Результаты и обсуждение
На сроках 14 и 30 сут от начала введения CCl4 существенного изменения состояния животных в опытной группе по сравнению с контрольной не произошло. При увеличении продолжительности введения CCl4 на 90-е сут у животных наблюдались признаки общего угнетения, легкая желтушность видимых слизистых оболочек. Отмечено снижение аппетита, наблюдалось увеличение потребления воды, которое возросло в 1,5 раза по сравнению с таковым у животных в контрольной группе. После забоя животных наблюдалось возрастание относительной массы печени на 30% в группах 30 и 90 дней по сравнению с относительной массой у животных контрольной группы.
При гистологическом исследовании найдено, что на 14-е сут наблюдались выраженная жировая дистрофия гепатоцитов, очаговый некроз гепатоцитов, начальный фиброз центральных вен, портальных трактов, расширение портальных вен, синусоидов, отек портальных трактов, в гепатоцитах – белковая дистрофия. В группе с введением силимарина на фоне жировой дистрофии печени наблюдалось практически полное отсутствие явления начального фиброза печени у 4 животных из 5, тогда как в группе с введением CCl4 явления начального фиброза наблюдались у всех 5 животных. На 30-е сут наблюдались некрозы гепатоцитов, наличие воспалительного инфильтрата вокруг портальных трактов, отечность портальных трактов, фиброз портальных трактов с формированием коротких портопортальных септ, выраженная крупнокапельная инфильтрация перипортальных гепатоцитов. Наблюдались проявления пролиферации гепатоцитов: анизокариоз, увеличение числа митозов, наличие двуядерных гепатоцитов. Отмечены участки внутриклеточного холестаза в перипортальных гепатоцитах, гиперплазия клеток ретикулума эндотелиальной системы. Введение силимарина на 30-е сут не повлияло на интенсивность жировой и токсической дистрофии, а также не привело к уменьшению явлений очагового некроза. Вместе с тем явления фиброза так же, как на сроке 14 сут, уменьшились, что выражалось в уменьшении портопортальных септ и количества животных с явлениями фиброза в группе CCl4 с 80 до 40% в группе с применением силимарина. На 90-е сут исследования в ткани печени наблюдались крупнокапельная жировая инфильтрация гепатоцитов, расширение синусоидов, наличие участков ацидофильной дистрофии, присутствие крупноядерных клеток (активация регенераторного процесса по замещению некротизированных клеток печени), что свидетельствует о стимуляции регенераторных процессов при введении CCl4. На сроке 90 сут увеличилось количество соединительной ткани вокруг портальных трактов, отмечались наличие портопортальных и портоцентральных септ, формирование ложных долек (у всех животных, которым вводили CCl4), что характерно для ранних стадий цирроза печени. Введение силимарина существенно не влияло на жировую инфильтрацию печени. При исследовании соединительной ткани в группе с введением силимарина найдено, что у 2 животных в группе фиброз был выражен слабо (в виде перипортального фиброза) без формирования септ и ложных долек, а в 3 случаях обнаружено формирование ложных долек. Начальные проявления фиброза уменьшились (до 60% случаев), что свидетельствует о тенденции к снижению тяжести фибротического процесса под воздействием силимарина.
При исследовании уровня TNF-α в различные сроки от начала введения CCl4 наблюдалось возрастание уровня цитокина в сыворотке крови на протяжении всего времени исследования (табл. 1). Повышение уровня TNF-α в сыворотке крови свидетельствует о ранней активации экспрессии этого провоспалительного цитокина и поддержании повышенного уровня в течение длительного периода, что способствует утяжелению патологического процесса. Синтез и секреция провоспалительных цитокинов способствуют возникновению и прогрессированию фиброза печени [11]. TNF-α продуцируется макрофагами, моноцитами, Т-клетками в ответ на повреждение печени различными агентами при заболеваниях этого органа и воздействии таких токсических веществ, как CCl4. Кроме того, TNF-α вырабатывается гепатоцитами и звездчатыми клетками [12]. При возрастании уровня TNF-α резко увеличивается апоптоз гепатоцитов [13]. Введение силимарина на 14-е сут сопровождается снижением уровня TNF-α в сыворотке крови, на 30-е сут наблюдалась тенденция к стимуляции выхода TNF-α в сыворотку крови. Эта тенденция наблюдалась и на 90-е сут от момента введения CCl4.
При исследовании уровня TGF-β зафиксированы его возрастание на 14-е сут после введения CCl4 и умеренный рост на 90-е сут (табл. 1). TGF-β является основным фактором, стимулирующим звездчатые клетки. Как правило, уровень TGF-β коррелирует с тяжестью фибротического процесса [14]. Умеренное возрастание уровня TGF-β может свидетельствовать об умеренной тяжести фибротического процесса, что соответствует данным проведенного морфологического исследования. При введении силимарина уровень TGF-β повышался на 30-е сут от начала введения CCl4 и снижался на 90-е сут.
При исследовании уровня IL-10 отмечалось его снижение в сыворотке крови подопытных животных на протяжении всего времени наблюдения. Отчетливо выраженная тенденция к снижению уровня IL-10 наблюдалась до 90-х сут (табл. 1). Снижение уровня IL-10 свидетельствует о ухудшении иммунорегулирующей функции цитокина и способствует более интенсивному повреждению печени и стимуляции фиброгенеза под воздействием CCl4 [5]. Снижение уровня IL-10 может способствовать прогрессированию фиброза печени, т. к. он обладает антифиброгенными свойствами [15]. Кроме того, IL-10 стимулирует апоптоз звездчатых клеток [16, 17], что подавляет продукцию ими TGF-β. Введение силимарина сопровождается достоверным стимулирующим влиянием на уровень IL-10 в сыворотке крови: так, в группе с введением силимарина уровень IL-10 нормализовался на 30-е и 90-е сут наблюдения, при этом рост на 30-е сут составил 305% по сравнению с группой с введением CCl4, а на 90-е сут возрастание составило 320% (табл. 1). Таким образом, IL-10 оказывает многостороннее сдерживающее влияние на фиброгенез, и тенденция к его длительному снижению наряду с повышением уровня TNF-α и умеренным повышением уровня TGF-β свидельствует о профиброгенном воздействии и развитии фиброза печени при хроническом воздействии CCl4.
Комплексное исследование провоспалительного TNF-α и противовоспалительного IL-10 и TGF-β свидетельствует о разнонаправленном изменении соотношения этих маркеров в сыворотке крови на ранних этапах развития фиброза печени. При этом существенным является значительное снижение противовоспалительного и антифиброгенного IL-10 на фоне умеренно выраженного увеличения TGF-β и значительного увеличения TNF-α, что сопровождается развитием фиброза в ткани печени. Восстановление уровня IL-10 при применении силимарина у животных, которым вводили CCl4, даже при отсутствии существенного воздействия на уровень TGF-β и TNF-α снижает тяжесть фиброза на ранних стадиях фиброгенеза печени.
При исследовании прямых маркеров фиброгенеза – коллагена-IV и гиалуроновой кислоты найдено, что уровень коллагена-IV возрос в сыворотке крови подопытных животных до 301% (p<0,05), 482% (p<0,05) и 502% на 14-е, 30-е и 90-е сут соответственно (табл. 1). Возрастание уровня коллагена-IV является значительным проявлением патологического процесса в печени с учетом того, что коллаген-IV – важный структурный элемент базальных мембран и повышение его уровня в крови свидетельствует о его замене в базальной мембране на фибриллярные коллагены [18]. Исследование уровня гиалуроновой кислоты показало снижение до 61% (p>0,05) и 71% (p>0,05) на 30-е и 90-е сутки. Исследование уровня гиалуроновой кислоты, синтезируемой звездчатыми клетками, считается одним из чувствительных показателей активности фибротического процесса [19], однако высокий уровень гиалуронана в крови может быть отражением его повышенного синтеза в других тканях и не связан с патологией печени [20].
Следует отметить, что гиалуроновая кислота является наиболее лабильным элементом внеклеточного матрикса и может подвергаться интенсивному ферментативному (гиалуронидазы) и неферментативному разрушению. Обмен гиалуроновой кислоты происходит значительно быстрее, чем обмен коллагенов [21]. Молекулы гиалуроновой кислоты разрушаются внеклеточно. Неферментативное разрушение происходит под воздействием активных радикалов кислорода [22]. Разрушение такого рода, как правило, присутствует в местах воспаления и повреждения тканей. Тенденция к снижению уровня гиалуроновой кислоты, вероятно, свидетельствует об активации как ее ферментативного разрушения гиалуронидазами, так и неферментативного разрушения активными радикалами кислорода и хлора на начальных стадиях формирования фиброза печени под воздействием CCl4.
Введение силимарина не оказало существенного воздействия на уровни коллагена-IV и гиалуроновой кислоты в сыворотке крови у подопытных животных.
Выводы
1. Начальные признаки фиброза в печени возникают через 14 дней от начала введения CCl4 и выражаются в фиброзировании центральных вен и портальных трактов (F1). Начало формирования септ наблюдается на 30-е сут от введения CCl4 (F2). На 90-е сут исследования отмечаются формирование портопортальных септ, портоцентральных септ, начало формирования ложных долек – начальных стадий фиброза печени (F3).
2. Силимарин способствовал снижению тяжести фиброза в экспериментальных группах и уменьшению количества животных с проявлениями фиброза.
3. При исследовании уровня цитокинов зафиксировано значительное снижение уровня TNF-α, умеренно выраженное повышение уровня TGF-β, снижение уровня IL-10 на протяжении всего времени исследования.
4. Силимарин способствовал нормализации уровня IL-10 в сыворотке крови и не оказывал существенного влияния на уровни TGF-β и TNF-α у подопытных животных.
5. В крови повышен уровень коллагена-IV на протяжении всего времени исследования, и имеется тенденция к снижению уровня гиалуроновой кислоты на 30-е, 90-е сут от начала введения CCl4.
6. Силимарин не оказывал существенного влияния на уровень коллагена-IV и гиалуроновой кислоты на протяжении всего времени исследования.
