Для цитирования. Львов Н.Д., Панюкова Е.М. Новые подходы к диагностике папилломавирусной инфекции // РМЖ. Акушерство и гинекология. 2016. No 5. С. 325–327.
Одним из важнейших достижений в изучении этиологии рака принято считать установление факта причинно-следственной связи между папилломавирусной инфекцией (ПВИ) и раком шейки матки (РШМ) [7]. В настоящее время в мире ежегодно регистрируется до 500 тыс. новых случаев РШМ. При раке в 90–100% случаев в опухолевом материале из шейки матки обнаруживается ДНК папилломавирусов человека (ВПЧ), в то время как инфицированность в популяции здоровых женщин не превышает 5–20% [7]. Исследования показали, что 95% неоплазий шейки матки содержат разновидности ВПЧ, принадлежащие к типам «высокого риска» (ВПЧ 16, 18, 31, 33 и 45) [11]. Диагностика ПВИ обладает высокой клинической значимостью, т. к. позволяет очертить группу онкологического риска, т. е. выявить среди здоровых женщин тех, кому в первую очередь необходимо проведение активных комплексных мер, направленных на профилактику и раннюю диагностику РШМ. В настоящее время тестирование на ПВИ широко применяется в скрининговых программах по профилактике и ранней диагностике РШМ. Согласно проспективным исследованиям, признаки ранних предраковых изменений выявляются не менее чем у 15–50% женщин, продемонстрировавших положительный ВПЧ-тест на фоне нормального цервикального эпителия, причем время морфологической трансформации измеряется всего несколькими годами или даже месяцами [9, 10, 15]. Диагностика ПВИ стала достоверной лишь с появлением методик, основанных на детекции нуклеиновых кислот – гибридизации ДНК и полимеразной цепной реакции (ПЦР).В зависимости от целей и возможностей лабораторий широко применяются различные техники гибридизации, такие как Саузерн-блот, дот-блот, in situ, filter in situ и т. д. [16, 17]. Все они основаны на использовании ВПЧ-ДНК в качестве молекулярного зонда, предварительно меченного радиоактивной или биохимической меткой.
Бесспорными преимуществами в детекции ВПЧ обладает метод Саузерн-блот-гибридизации. По сравнению с другими этот метод характеризуется высокими чувствительностью, специфичностью и информативностью [17]. При осуществлении Саузерн-блота клеточная ДНК обрабатывается специфическими эндонуклеазами рестрикции, и полученные фрагменты с помощью электрофореза разделяются в агарозном геле. После денатурации ДНК переносится на мембрану, которая в дальнейшем гибридизуется с меченным ВПЧ-зондом. При оптимальном подборе специфических зондов и условий гибридизации можно получить сведения о физическом статусе ВПЧ-ДНК в клетке, типах ВПЧ, филогенетической взаимосвязи папилломавирусов и т. д. [17–20]. Недостатками данного метода являются трудоемкость и длительность выполнения процедуры, а также необходимость использования относительно больших количеств биологического материала для анализа. Эти факторы затрудняют использование Саузерн-блот-гибридизации для рутинной диагностики и решения задач скрининга.
Методики, основанные на реакции гибридизации, менее чувствительны к контаминации, чем ПЦР-диагностика, поэтому они являются методом выбора в тех условиях, когда правильная организация ПЦР-лаборатории невозможна или положительные результаты ПЦР-теста вызывают сомнения.
В течение последнего десятилетия лидирующее место в клинической диагностике ПВИ заняли методы, основанные на проведении реакции ПЦР, что связано с ее высокой разрешающей способностью, технической простотой и быстротой [21, 22].
Первоначально для ПЦР использовались типоспецифические (TS) праймеры, которые амплифицировали ДНК-последовательности строго определенного типа ВПЧ. Более поздние разработки объединяли несколько пар праймеров в одной реакции амплификации [23]. Многочисленные результаты подтвердили высокую чувствительность данных тест-систем, особенно для онкогенных типов ВПЧ [24]. Однако TS-ПЦР охватывает относительно узкий спектр разновидностей ВПЧ, поэтому ее применение имеет определенные ограничения.
Для скрининговых и эпидемиологических исследований более эффективны ПЦР-методы, в которых используются консенсусные (или «общие») пары праймеров [25]. С их помощью можно выявлять широкий спектр ВПЧ-генотипов, включая новые, неидентифицированные типы.
Несмотря на высокую потенциальную опасность, носительство ВПЧ свидетельствует не о злокачественном процессе как таковом, а о многократно повышенном риске возникновения последнего. Факторы, модифицирующие патогенность ПВИ и, как следствие, провоцирующие опухолевый рост у инфицированных женщин, остаются неизвестными [8, 13].
В публикациях и докладах 1993–2011 гг. (Львов Н.Д.) обосновывается целесообразность комплексного обследования пациентов с целью выявления вирусо-вирусных и вирусо-бактериальных ассоциаций [2, 3].
С целью выявления частоты встречаемости вирусо-вирусных, вирусо-бактериальных и вирусо-протозойных ассоциаций у женщин репродуктивного возраста мы провели комплексное обследование 273 пациенток в возрасте от 22 до 34 лет, включавшее: выявление ВПЧ высокого и низкого канцерогенного риска в соскобах из урогенитального тракта при помощи методов ПЦР и гибридного захвата (ВПЧ Digene-test), изоляцию цитомегаловируса (ЦМВ) в культуре клеток из мочи, слюны, крови, цервикального и вагинального отделяемого, определение маркеров вируса простого герпеса (ВПГ) 1/2 методом иммуноферментного анализа (ИФА), ВПГ – 4 методом ИФА, диагностику хламидий, микоплазм, уреаплазм, трихомонад методом ПЦР, микроскопическое и бактериологическое исследование микрофлоры цервикального канала, влагалища и уретры [5], цитологическое исследование и атомно-силовую микроскопию соскобов с шейки матки и цервикального канала [1].
Инфекции, передаваемые половым путем, диагностированы у 64% обследованных женщин. У 20% выявлены трихомонады, у 7% – микоплазмы, у 20% – уреаплазмы, у 4% – хламидии, у 33% – ВПЧ, у 30% – ВПГ. Причем у 24% из них обнаружена протозойно-бактериально-вирусная ассоциация (трихомонадная, мико-, уреаплазменная, герпетическая, ПВИ), у 7% – вирусная ассоциация (реактивированная герпетическая, ПВИ), у 16% выявлено наличие только скрытых урогенитальных инфекций или их ассоциаций: у 13% – хламидийная инфекция, у 3% – хламидийно-уреаплазменная. ЦМВ был выявлен методом изоляции в культуре клеток у 47% обследованных женщин. Выделение ЦМВ проводилось одновременно из материала проб 5 биологических жидкостей: у 12% он был выявлен в моче, у 4% – в слюне, у 6% – в крови, у 13% – в цервикальной слизи и у 12% – в выделениях из влагалища.
ПВИ была выявлена методом ПЦР у 33% обследованных женщин. Из них ВПЧ высокого онкогенного риска в цервикальном канале выделен у 27% пациенток: 16 тип – у 10% женщин,18 тип – у 7%, 31 тип – у 4%, 52 тип – у 6%. ВПЧ низкого онкогенного риска выделен у 6% пациенток: 6 тип – у 3% женщин, 11 тип – у 2%, 44 тип – у 1%. Большинство исследователей отмечают значительное разнообразие типов папилломавирусов, выявляемых в каждой отдельно взятой популяции [14]. По данным литературы, у здоровых женщин, так же как и у больных РШМ, наиболее часто обнаруживается ВПЧ-16. В 1,5–2 раза реже выявляется ВПЧ-18. Суммарно на долю ВПЧ-16 и -18 приходится 45% от общего числа всех генитальных папилломавирусов [8]. Распределение ВПЧ по типам подвержено определенным этнико-географическим колебаниям. Например, для стран Азии характерна относительно высокая встречаемость ВПЧ-52 и -58 [12], в то время как на Филиппинах и в странах Латинской Америки несколько увеличена представленность ВПЧ-45 [13].
По результатам нашего исследования, у женщин с неоплазиями шейки матки 16 тип ВПЧ выявляется в 33,3% случаев, 18 тип – в 28,6%, 31 тип – в 19%, 52 тип – в 14,3%, 56 тип – в 4,8%. Показатели ВПЧ Digene-testa у обследованных женщин колебались от 2 до 2080 относительных единиц (рис. 1).
По нашим данным, наиболее часто ПВИ выявляется в возрастной группе от 25 до 29 лет (до 20 лет – у 3,7%, в 20–24 года – у 33,3%, в 25–29 лет – у 37%, в 30–34 года – у 22,2%, в 35– 39 лет – 3,7%), по данным Американской ассоциации здравоохранения (American Public Health Association (APHA)) – от 20 до 24 лет (рис. 2).
По данным анамнеза, у обследованных женщин с ПВИ в 11,1% случаев встречались воспалительные заболевания, в 3,7% – эндометриоз, в 7,4% – бесплодие, в 11,1% – миома, у 7,4% пациенток выявлена дисфункция яичников. Полученные нами ранее данные [4] показали, что у женщин с ПВИ чаще, чем в контрольной группе, встречается миома матки (рис. 3).
В нашем исследовании у женщин с ПВИ был выявлен ВПЧ как моноинфекция только у 45% пациенток. У 7% определялась вирусная ассоциация (реактивированная герпетическая и ПВИ), а у 14% – протозойно-бактериально-вирусная ассоциация (трихомонадная, микоплазменная, герпетическая, ПВИ). При этом у 3% пациенток была выявлена вирусная ассоциация (реактивированная герпетическая и ПВИ), а у 6% – протозойно-бактериально-вирусная ассоциация (трихомонадная, мико-, уреаплазменная, герпетическая, ПВИ).
У пациенток с фоновыми заболеваниями и легкой дисплазией шейки матки антитела к вирусу герпеса 4 типа выявлялись в 50% случаев, у пациенток с тяжелой дисплазией – в 66%, с плоскоклеточным РШМ – в 83%.
При изучении показателей интерферонового статуса у 76% пациенток была снижена продукция интерферона- до 40 (при норме от 128 до 640), у 54% – снижена продукция интерферона- до 16 (при норме от 32 до 256). Причем у женщин с моноинфекцией (ПВИ) наиболее часто (75%) отмечается снижение продукции -интерферона, а у пациенток с сочетанной вирусно-бактериальной инфекцией – снижение продукции - и -интерферона (72,7%) [6].
Некоторые исследователи выявили уменьшение количества клеток Лангерганса при ПВИ гениталий, кондиломах [26, 27]. Вероятно, уменьшение плотности клеток Лангерганса в эпидермисе ВПЧ-инфицированных тканей просто представляет собой выход антигенпрезентирующих клеток Лангерганса из эпителия в лимфатические узлы для презентации антигена нативными Т-лимфоцитами [28]. Цитокины являются важным медиатором миграции клеток Лангерганса из ВПЧ-инфицированных тканей в лимфатические узлы. Особенно важна роль цитокинов ИЛ-1 и фактора некроза опухоли (в основном секретируемых кератиноцитами) и ИЛ-1 (в основном секретируемого клетками Лангерганса), которые промотируют миграцию клеток Лангерганса, и ИЛ–10, секретируемого кератиноцитами [29]. Возможная ассоциация между дефицитом цитокинов и персистенцией ВПЧ была постулирована [30] на основании факта снижения уровня цитокинов (ИЛ-1 и -1b, TNF, гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующего фактора) в некоторых ВПЧ-инфицированных цервикальных клеточных линиях и цервикальных опухолевых линиях. Также было показано, что экспрессия TNF кератиноцитами отсутствует в SIL (плоскоклеточные интраэпителиальные повреждения)-биопсированных тканях, но присутствует во всех биоптатах нормального цервикального плоскоклеточного эпителия [31]. И наоборот, экспрессия ИЛ-10 кератиноцитами представлена во всех SIL-биопсированных тканях, но отсутствует в нормальном эпителии. Таким образом, повреждения в системе регуляции экспрессии указанных цитокинов могут отразиться на представлении антигенов в инфицированных тканях клеткам Лангерганса, что может привести к увеличению риска ПВИ или ассоциированных заболеваний.
Таким образом, комплексное обследование пациентов и выявление вирусо-вирусных и вирусо-бактериальных ассоциаций целесообразны с целью выявления факторов, возможно модифицирующих патогенность ВПЧ и, как следствие, провоцирующих канцерогенез у инфицированных женщин.