Протективная активность интерферона в комбинации с различными антиоксидантами в отношении экспериментальной летальной гриппозной инфекции

Ключевые слова
Похожие статьи в журнале РМЖ

Читайте в новом номере

Импакт фактор - 0,584*

*пятилетний ИФ по данным РИНЦ

Регулярные выпуски «РМЖ» №28 от 30.10.2012 стр. 1416
Рубрика: Клиническая фармакология

Для цитирования: Зарубаев В.В., Слита А.В., Калинина Н.А., Гаршинина А.В., Штро А.А., Карпинская Л.А. Протективная активность интерферона в комбинации с различными антиоксидантами в отношении экспериментальной летальной гриппозной инфекции // РМЖ. 2012. №28. С. 1416

Введение Грипп представляет собой широко распространенную во всем мире респираторную инфекцию. Он вызывает ежегодные эпидемии, быстро распространяющиеся из страны в страну, вовлекая в тяжелых случаях (пандемии) значительную часть человеческой популяции земного шара. Он также является причиной 20 000 – 40 000 смертельных исходов в США в год [Ghendon Y., 1992]. Несмотря на успехи, достигнутые в области химиотерапии, вакцинопрофилактики и иммунологии гриппа, он остается трудно контролируемой инфекцией вследствие высокой генетической изменчивости и различных долговременных осложнений после острой стадии, приводящих к «скрытой», или вторичной, смертности, вызванной не самим вирусом гриппа, но вирус–индуцированными вторичными процессами [Zambon M., 1999].

Грипп представляет собой широко распространенную во всем мире респираторную инфекцию. Он вызывает ежегодные эпидемии, быстро распространяющиеся из страны в страну, вовлекая в тяжелых случаях (пандемии) значительную часть человеческой популяции земного шара. Он также является причиной 20 000 – 40 000 смертельных исходов в США в год [Ghendon Y., 1992]. Несмотря на успехи, достигнутые в области химиотерапии, вакцинопрофилактики и иммунологии гриппа, он остается трудно контролируемой инфекцией вследствие высокой генетической изменчивости и различных долговременных осложнений после острой стадии, приводящих к «скрытой», или вторичной, смертности, вызванной не самим вирусом гриппа, но вирус–индуцированными вторичными процессами [Zambon M., 1999].
Вакцинация против гриппа является эффективным противоэпидемическим средством, однако вследствие постоянной смены антигенных свойств возбудителя требуются непрерывный мониторинг и разработка новых вакцинных штаммов, соответствующих циркулирующим в человеческой популяции в каждый конкретный эпидемический сезон.
Новые вирусы гриппа птиц H5N1 и свиней H1N1, появившиеся в человеческой популяции в последние годы, являются опасным патогеном человека. Большинство человеческих изолятов вируса устойчивы к действию наиболее распространенного противогриппозного препарата – ремантадина и способны эффективно подавлять интерфероновый ответ организма. Кроме того, серотипы этих вирусов являются новыми для иммунной системы человека, вследствие чего к данным возбудителям отсутствует коллективный иммунитет. Перечисленные свойства делают неэффективными такие способы защиты человека, как химиотерапия, специфический и неспецифический иммунный ответ.
Таким образом, ситуация, сложившаяся в последние 2 года в отношении инфицирования человека вирусом гриппа, придает особую актуальность поискам новых эффективных средств профилактики и борьбы с этой инфекцией.
Химиопрофилактика и химиотерапия гриппа применяются наряду с вакцинацией для предотвращения и лечения заболевания. В настоящее время для этих целей доступен широкий спектр патогенетических, иммуномодулирующих, общеукрепляющих препаратов наряду со средствами специфической противогриппозной терапии. Последняя группа препаратов представлена химическими соединениями двух групп, отличающихся по механизму действия и мишеням в жизненном цикле вируса гриппа. Препараты 1–й группы – ремантадин (a–метил–1–адамантил–метиламина гидрохлорид) и амантадин (1–аминоадамантан) – блокируют белок М2 вируса гриппа, играющий роль ионного канала в вирусной мембране, препятствуя тем самым процессу расщепления гемагглютинина и слияния мембран вируса и лизосомальной вакуоли [Scholtissek C. et al., 1998].
Действие препаратов 2–й группы направлено на ингибирование вирусной нейраминидазы – фермента, необходимого для нормального почкования вирусных частиц и проявления инфекционных свойств вируса гриппа. К этой группе соединений относятся занамивир (5–(ацетиламино)–4–[(аминоиминометил)–амино]–2,6–ангидро–3,4,5–тридезокси–D–глицеро–D–галакто–нон–2–еноновая кислота) и озелтамивир [Colman P., 1999].
Обе группы соединений имеют свои недостатки. В отношении группы производных адамантана можно отметить сравнительно высокую токсичность, узкий спектр действия (препараты активны против гриппа А, но не против гриппа В) и быстрое формирование устойчивости вируса к препаратам. Для ингибиторов нейраминидазы характерны несколько меньшая клиническая эффективность и высокая стоимость синтеза, что делает эти препараты менее доступными для широкого использования.
Все вышесказанное свидетельствует о необходимости поиска и разработки эффективных и дешевых противогриппозных препаратов как можно более широкого спектра действия.
Ранее было проведено доклиническое исследование противовирусной активности антиоксидантов в комбинации с интерфероном в отношении вируса гриппа А/Калифорния/07/09 (H1N1)pdm09 в культуре клеток, в ходе которого было показано, что добавки антиоксидантов повышают уровень противовирусной активности интерферона по сравнению с монопрепаратом интерферона [Зарубаев В.В. и соавт., 2012]. По соотношению токсичности и активности оптимальной комбинацией оказалась комбинация интерферона с таурином, превосходящая интерферон в виде монопрепарата примерно в 1,5 раза. Целью настоящего исследования было оценить влияние комбинаций интерферона с антиоксидантами на течение острой экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гриппа, in vivo.
Материалы и методы
Препараты. В работе использовали следующие субстанции препаратов: рекомбинантный человеческий интерферон альфа–2b (далее рчИФН–α2b), таурин, аскорбиновая кислота (далее – АК), токоферола ацетат. Комбинации препаратов формировали, исходя из следующих соотношений:
• рчИФН–α2b + таурин в соотношении 125 000 МЕ : 5,0 мг (т.е. 10:0,0004);
• АК + токоферола ацетат в соотношении 55 мг : 55 мг (т.е. 1:1);
• рчИФН–α2b + АК + токоферола ацетат в соотношении 150 000 МЕ : 55 мг : 55 мг (т.е. 10 : 0, 0033 : 0,0033).
В качестве референс–препарата использовали ремантадин (α–метил–1–адамантил–метиламина гидрохлорид, AldrichChem.Co., Milw.,WI, cat. #39.059–3) в дозе 50 мг/кг веса в сутки.
Аликвоты препаратов разводили в среде для клеточных культур Игла МЕМ [Биоло Т., Санкт–Петербург, кат.# 1.3.3]. Из полученного раствора готовили необходимые разведения на среде МЕМ для экспериментов на животных.
Вирусы. В работе был использован адаптированный к мышам вирус гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2). Вирус пассировали в аллантоисной полости 10–12 дневных куриных эмбрионов в течение 48 ч при 36°С.
Животные. Белых беспородных мышей (самки) массой 16–20 г получали из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.) и содержали на стандартном рационе в условиях вивария ФГБУ «НИИ гриппа». Подбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки. До начала испытаний животные находились под наблюдением 1 нед.
Экспериментальная гриппозная инфекция
Для заражения животных была использована вирус–содержащая аллантоисная жидкость куриных эмбрионов. Из нее готовили серию 10–кратных разведений на физиологическом растворе, после чего инфекционную активность вируса в заражающем материале определяли в отдельном эксперименте при помощи титрования по летальности на животных. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча [Am.J. Hyg.,1938, 27: 493–497].
Исследуемые препараты вводили животным внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл по лечебно–профилактической схеме (начиная с 1 сут. до инфицирования, 2 раза/сут. в течение 5 дней после заражения). Препарат сравнения применяли по той же схеме. В качестве плацебо контрольной группе животных вводили физиологический фосфатный буфер. В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы.
Вирус вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом в дозе 1 и 10 LD50. На 3–й день после заражения 5 животных из каждой группы умерщвляли, вскрывали и изолировали легкие, которые использовали для выделения вируса (замораживали и хранили при –20°С до постановки соответствующих экспериментов).
Наблюдение за оставшимися животными осуществляли в течение 14 дней, т.е. срока, в течение которого при экспериментальном гриппе отмечается смертность животных. Ежедневно фиксировали смертность животных в контрольных и опытных группах. На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (M, отношение числа умерших за 14 дней животных к общему числу зараженных животных в группе), индекс защиты
(IP, отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в контрольной группе) и среднюю продолжительность жизни животных (СПЖ) из расчета 14 дней наблюдения в соответствии со следующими формулами:
СПЖ=(ΣND)/Nt, где N – количество животных, проживших D дней,
Nt – общее число животных в группе;
M=M/Nt, где M – число животных в группе, умерших в течение 14 дней после заражения,
IP=((Mc–Me)/Mc)×100%, где Mc и Me – смертность в процентах в контрольной и опытной группах соответственно.
Титрование вируса в легочной ткани
Для определения инфекционного титра вируса гриппа в легочной ткани животных легкие мышей, извлеченные на 3–и сут. после инфицирования, гомогенизировали в 10–кратном объеме стерильного физиологического фосфатного буфера и готовили из гомогенатов серию 10–кратных разведений на том же буфере. При определении титра вируса гриппа использовали культуру клеток MDCK (ATCC# CCL–34), выращенных на 96 луночных панелях на среде МЕМ. Клетки заражали серийными 10–кратными разведениями легочного гомогената от 10 до 10–7 и инкубировали в термостате в течение 48 ч. По окончании срока инкубации культуральную жидкость переносили в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1% куриных эритроцитов в физиологическом растворе.
Уровень репродукции вируса в лунках панели оценивали по реакции гемагглютинации (РГА) эритроцитов. За титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации, и выражали в логарифмах 50% экспериментальной инфекционной дозы вируса (lg ЭИД50).
Статистическая обработка данных
Нормальность распределения величин проверяли при помощи критерия Колмогорова–Смирнова в пакете программ Statistica 8.0. Статистическую обработку результатов (расчет средних значений и ошибки среднего) проводили при помощи программы Microsoft Excel. Достоверность отличий оценивали по критерию Стьюдента (Microsoft Excel) в случае нормально распределенных величин и критерия Манна–Уитни (Statistica 8.0) при распределении, отличном от нормального. Достоверными считали различия между группами, если параметр p не превышал 0,05.
Результаты и обсуждение
Протективная активность препаратов в опытах на животных
В ходе опыта по определению протективной активности изученных препаратов на животных не было отмечено неспецифической смертности в контрольной группе интактных животных. Клинические признаки заболевания были типичными для гриппозной инфекции. Они включали затрудненное дыхание, атаксию, тремор, а также снижение потребления корма и воды. Данные по динамике смертности животных в контрольных и опытных группах суммированы в таблице 1 и для наглядности приведены на рисунке 1.
Как видно из представленных данных, инфицирование животных приводило к дозозависимой смертности животных в группах опыта, начиная с 6 сут. после инфицирования. Применение ремантадина снижало смертность (на 71–75%) и повышало продолжительность жизни животных (2,9–5,5 сут. в зависимости от инфицирующей дозы) по сравнению с контрольными показателями.
Применение всех исследованных препаратов приводило к более или менее выраженному протективному эффекту. Так, использование рекомбинантного интерферона по лечебно–профилактической схеме снижало смертность животных на 30–40% по сравнению с контролем в зависимости от множественности инфицирования. Терапия животных интерфероном в комбинации с таурином снижала показатели смертности на 43–46%, тогда как использование таурина в виде монопрепарата практически не влияло на показатели смертности (индекс защиты 7,7–14,3%). Использование токоферола в комбинации с аскорбиновой кислотой хотя и умеренно снижало смертность животных (на 14–23% в зависимости от дозы вируса), но не повышало эффективности интерферона при совместном применении, несмотря на очевидную разницу в механизмах действия этих препаратов.
Таким образом, по данным, полученным в ходе исследования, наиболее эффективной оказалась комбинация рекомбинантного интерферона с таурином.
Влияние препаратов на репродукцию вируса гриппа в организме животных
На следующем этапе исследования было изучено влияние комбинаций на репликативную активность вируса гриппа в ткани легких инфицированных животных. С этой целью из легких животных на 3–и сут. после заражения были приготовлены гомогенаты, в которых затем определяли инфекционный титр вируса в культуре клеток.
Данные об уровне репликации модельного вируса гриппа в организме животных приведены в таблице 2 и для наглядности представлены графически на рисунке 2.
Как видно из приведенных результатов, модельный вирус размножался в легких мышей до титров 6,1–6,4 log10EID50/20 мг ткани в зависимости от инфицирующей дозы. Применение ремантадина достоверно снижало уровень репродукции вируса приблизительно на два порядка, что согласуется с данными о чувствительности модельного вируса к ремантадину.
При использовании препаратов интерферона в виде монопрепарата или в комплексе с антиоксидантами также отмечалось снижение инфекционной активности вируса приблизительно на порядок. При этом сами по себе антиоксиданты не приводили к достоверному ограничению вирусной репродукции, однако усиливали эффект интерферона, будучи применены с ним в комплексе.
Заключение
В настоящем исследовании проведено изучение противовирусной активности рекомбинантного человеческого интерферона в комбинациях с антиоксидантами – таурином, аскорбиновой кислотой и токоферолом – на модели летальной пневмонии у белых мышей, вызванной вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2).
Показано, что лечебно–профилактическое применение интерферона оказывает протективное действие при гриппозной пневмонии. Это проявлялось в снижении специфической смертности, увеличении продолжительности жизни экспериментальных животных по сравнению с контрольными группами, а также в снижении инфекционных титров вируса в ткани легких. Совместное применение интерферона с антиоксидантами оказывало больший эффект по сравнению с интерфероном в виде монопрепарата. Наибольшей активностью из изученных антиоксидантов обладал таурин. Учитывая, что воспаление и неспецифические окислительные процессы в очаге воспаления являются ведущим фактором патогенности при гриппе [Tisoncik J.R. et al., 2012], полученные нами результаты находятся в соответствии с теоретическими представлениями о протективном действии антиоксидантов при гриппе. При использовании в комбинации с интерфероном, непосредственно ограничивающим репродукцию вируса, эти препараты могут служить средством сопроводительной терапии при лечении гриппа, в том числе тяжелых его форм.

Таблица 1. Динамика смертности животных в ходе гриппозной пневмонии, вызванной вирусом гриппа A/Aichi/2/68 ( H3N2), в условиях применения химиопрепаратов
Рис. 1. Динамика смертности животных в ходе гриппозной пневмонии, вызванной вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), в условиях применения химиопрепаратов.
Рис. 2. Инфекционная активность вируса гриппа в ткани легких белых мышей, инфицированных вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), в условиях применения химиопрепаратов
Таблица 2. Репродукция вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в ткани легких белых мышей на фоне применения химиопрепаратов.


Литература
1. Ghendon Y Influenza – its impact and control // World Health Statistic Q. 1992. Vol. 45. Р. 306–311.
2. Zambon M.C. Epidemiology and pathogenesis of influenza. J. Antimicrob. Chemother. 1999. Vol. 44. Р. 3–9.
3. Scholtissek C., Quack G., Klenk H.D., Webster R.G. How to overcome resistance of influenza A viruses against adamantane derivatives // Antiviral Research. 1998. Vol. 37. Р. 83–95.
4. Colman P. A novel approach to antiviral chemotherapy for influenza. J Antimicrob Chemother. 1999. Vol. 44. Top. B. Р. 17–22.
5. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J Immunol Methods. 1983. Vol. 65. Р. 55–63.
6. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints // Am. J. Hyg. 1938. Vol. 27. Р. 493–497.
7. Штро А.А., Карпинская Л.А., Галочкина А.В., Зарубаев В.В. Активность интерферона в комбинации с антиоксидантами против ДНК– и РНК–содержащих вирусов человека // Лечащий врач. 2012. № 10 от 19 ноября (в печати).
8. Tisoncik J.R., Korth M.J., Simmons C.P., Farrar J., Martin T.R., Katze M.G. Into the eye of the cytokine storm // Microbiol Mol Biol Rev. 2012 Mar. Vol. 76 (1). Р. 16–32.


Оцените статью


Поделитесь статьей в социальных сетях

Порекомендуйте статью вашим коллегам

Предыдущая статья
Следующая статья

Авторизируйтесь или зарегистрируйтесь на сайте для того чтобы оставить комментарий.

зарегистрироваться авторизоваться
Наши партнеры
Boehringer
Jonson&Jonson
Verteks
Valeant
Teva
Takeda
Soteks
Shtada
Servier
Sanofi
Sandoz
Pharmstandart
Pfizer
 OTC Pharm
Lilly
KRKA
Ipsen
Gerofarm
Gedeon Rihter
Farmak