of the activity of nucleosidediphosphatekinase
A.E. Egorov, E.V. Andrianova, D.V. Katz
Department of Ophthalmology of Medical Faculty
GOU VPO Russian State Medical University of Roszdrav, Moscow
The Institute of Bioorganic Chemistry named after
M.M. Shemyakin and U.A. Ovchinnikov.
Purpose: To estimate in the experiment the activity of nucleosidediphosphatekinase (NDPk) of retina and optic nerve as marker of the level of energy processes alteration, caused by limited and controlled inflammatory reaction after modified laser cyclocoagulation (MLCK).
Materials and methods: Standard MLCK was performed in 36 Shinshilla rabbits (36 eyes). Control group consisted of 36 paired in which no surgery was carried out. Activity of nucleosidediphosphatekinase of retina and optic nerve was assessed by biochemical methods in 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36 and 48 hours after the treatment.
Results: There was the dynamic change of the activity of NDPk. In group of control the activeness of NDPk was stable in the interval of 13,31–13,41 micro units of activity.
Conclusion. According to experimental data increase of NDPk’s activity was proved in the main group in comparison with control. This can be regarded as confirmation on biochemical level of MLCK positive effect on metabolic eye processes.
|
М |
ногочисленные исследования, проведенные в области изучения этиопатогенеза первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ), ее ранней диагностики, лечения, профилактики оставляют надежду на то, что это заболевание в скором будущем не будет являться одним из основных в структуре причин слепоты населения во всех странах мира.
Такая ситуация ставит перед клиницистами вопросы, ответить на которые могут только экспериментальные исследования. Так, в настоящее время одним из них является вопрос о коррекции метаболических нарушений сетчатки и зрительного нерва у пациентов с глаукомной оптической нейропатией. Диффузная и/или очаговая ишемия и гипоксия сетчатки и головки зрительного нерва являются одним из важнейших факторов в развитии необратимых изменений в заднем отделе глаза при глаукоме. Патофизиологические процессы, вызванные ишемией при различных заболеваниях, могут существенно различаться, но во всех случаях решающую роль играет гипоксия и ее последствия. Последствием гипоксии является ухудшение тканевого дыхания и дефицит в клетках молекулярного АТФ (аденозинтрифостат), который служит источником энергии для всех биологических процессов в организме [1–3]. В настоящее время подробно изучены процессы, протекающие в сетчатке при световосприятии. Известно, что участие в передаче зрительного сигнала принимает NDPk, которая катализирует реакцию переноса концевого фосфата с нуклеозид–5’–трифосфатов на нуклеозид–5’–дифосфаты. В сетчатке NDPk является основным ферментом, катализирующим синтез внутриклеточного GTP, субстрата трансдуцина и гуанилатциклазы, который контролирует процессы возбуждения и десенситизации зрительных клеток [4–7].
Особенно чувствительны к гипоксии ткани с высоким уровнем энергетического метаболизма. В глазу к таким тканям относятся сетчатка, зрительный нерв и в меньшей степени сосудистая оболочка. Список средств и методик, применяемых для лечения гипоксии, непрерывно расширяется. Однако достаточно полную проверку их эффективности при внутриглазной гипоксии прошли только немногие из них.
Транссклеральная диод–лазерная циклокоагуляция (ТЛЦК) достаточно хорошо известна в офтальмологии, как эффективная методика снижения повышенного ВГД вследствие деструкции отростков цилиарного тела [1]. Преимущество ТЛЦК с использованием диодного лазера (длина волны 810 нм) перед другими циклодеструктивными операциями заключается в поглощении энергии в основном в зоне пигментного эпителия цилиарного тела при хорошей сохранности других структур, через которые проходит лазерный луч.
Вместе с тем в последние годы благодаря модификации методики (модифицированная лазерная циклокоагуляция – МЛЦК) воздействия лазером на цилиарное тело наряду с гипотензивным эффектом удалось добиться значительного положительного влияния на состояние зрительных функций. Изменение методики достигается путем смещения места нанесения коагулятов кзади, в область проекции не только короны, но и плоской части цилиарного тела. Это имеет принципиальное значение. Модифицированная лазерная циклокоагуляция оказывает выраженное влияние на метаболические процессы в заднем отделе глаза. Эффект операции, заключающийся в повышении зрительных функций у больных с глаукомной оптической нейропатией (максимальное улучшение состояния полей и остроты зрения наступает через 7 дней после воздействия и остается стабильным в течение 6 месяцев наблюдений) широко используется в клинической практике, однако процессы, приводящие к этому, недостаточно изучены на биохимическом уровне.
Существует мнение, что в результате лазерного воздействия происходит локальное нарушение целостности пигментного эпителия в плоской части цилиарного эпителия и образуются биологические активные вещества, медиаторы воспаления, которые обладают вазодилатирующими свойствами. Эти субстанции, поступая в стекловидное тело, с его током достигают сетчатки и зрительного нерва, благотворно влияя на метаболизм этих структур, что способствует оптимизации зрительных функций [1, 3].
Цель исследования. Изучение в эксперименте активности нуклеозиддифосфаткиназы сетчатки, как маркера изменения уровня энергетических процессов, обусловленного ограниченной и управляемой воспалительной реакцией после модифицированной лазерной циклокоагуляции.
Материалы и методы. Работа проведена на 36 половозрелых кроликах породы «серая шиншилла» обоего пола, массой 2,5–3 кг. Перед операцией всем кроликам проводили премедикацию: в конъюнктивальную полость закапывали глазные капли оксибупрокаин 0,4% по 1–2 капли трехкратно с интервалом 5–7 минут.
Техника трофической МЛЦК. С помощью контактного лазерного зонда с умеренным вдавлением склеры в 3–5 мм от лимба на 6 часах в шахматном порядке в 3 ряда наносятся 8 лазерных коагулятов (рис. 1). Режим работы лазера следующий: мощность составляет от 0,4 до 0,5 Вт, экспозиция 3,0 с.
Операция проводилась на левых глазах кроликов. Правые глаза служили контролем.
Выведение кроликов из опыта производилось через 1 ч, 3 ч, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48 ч после воздействия.
Глазные яблоки удаляли с участком зрительного нерва. Энуклеированные глаза замораживали путем погружения в жидкий азот.
Методика определения активности нуклеозиддифосфаткиназа NDPk в ткани.
Предварительная подготовка. Замороженная в жидком азоте ткань (энуклеированный глаз) взвешивается и механически измельчается в фарфоровой ступке пестиком до порошкообразного состояния. Измельченный образец экстрагируется буфером А состава: 10 ммоль Трис–НCl, 0,5 ммоль ЕДТА (ЕДТА – комплексообразователь, который используется в сотых долях процента. По химической структуре – ди натриевые соли этилендиаминтетрауксусной кислоты. Комплексообразователь, связывает ионы металлов в растворимые соединения, используется как консервант и стабилизатор), рН=7,6 при +4°С, объем буфера 14 мл. Суспензия переносится в пластиковый флакон и 1 мл суспензии в течение 5 мин осветляется центрифугированием на 14 000 об/мин. Остальной экстракт замораживается и хранится при температуре –70°С. После центрифугирования осадок удаляется, а в аликвоте (часть осветленного экстракта, взятая для анализа) определяется ферментативная активность.
Определение активности NDPk. Нуклеозиддифосфаткиназа определяется по реакции переноса радиоактивной фосфатной группы от донора – [γ–32P]ATP к акцептору – UDP.
Реакция протекает по схеме:
РррА + ррU → ррА + РррU, где:
Р – радиоактивный остаток фосфата–32,
РррА – [γ–32P]ATP (аденозинтрифосфат)
РррU – [γ–32P]UTP (уридинтрифосфат),
‑ррU и ррА – уридин–5’дифосфат и аденозин–5’дифосфат.
Состав реакционной смеси для определения активности NDPk: 50 ммоль Трис–HCl, рН=7,8, 5 ммоль MgCl2, 1 ммоль UDP, 0,1 ммоль ATP, 100 мКи/ml [γ–32P]ATP, 5 ммоль a–глицеролфосфат. Общий объем – 20 мкл.
К реакционной смеси добавляется 5 мкл испытуемого раствора (осветленного экстракта), и смесь инкубируется 15 мин при температуре 37°С. В качестве отрицательного контроля вместо экстракта добавляется 5 мкл буфера А. В качестве положительного контроля использовался препарат NDPk, выделенный из E.coli, с известными характеристиками.
После инкубации из каждой реакционной смеси аликвоты по 1 мкл наносятся на пластинку с PEI–целлюлозой (полиэтилениминцеллюлоза используется при проведении модифицированной бумажной ионно–обменной хроматографии; этот вариант хроматографии позволяет разделять ионы и полярные молекулы, на основании зарядов разделяемых молекул) и хроматографируются в 0,5 моль однозамещенном фосфате калия. Пластинка высушивается и экспонируется на фосфоиммиджере «Сanberra–Packard» для измерения распределения радиоактивности в режиме реального времени. Типичная картина представлена на рисунке 2. Соотношение радиоактивности в продуктах реакции позволяет рассчитать ферментативную активность исследуемой аликвоты.
Расчет активности. За одну единицу ферментативной активности NDPk принимается количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в продукт за 1 мин при выбранных условиях реакции (t=37°C, pH=7,8). Для вышеприведенных условий: в реакционной смеси находится 2x10–9 моль (нмоль) АТР, т.к. UDP в избытке (UDP в 10 раз больше), то расчет ведется по количеству израсходованного АТР. На рисунке 3 пунктирной линией обозначена линия старта (точка нанесения реакционной смеси). Первые три зоны слева (A, B, C) по порядку: контроль γ ATP, контроль UTP и контрольный фермент. Последующие четыре зоны (D, E, F, G) – опытные образцы (для наглядности использовали образцы при трофической МЛЦК через 6, 9, 12, 18, часов после воздействия лазера D, E, F, G соответственно), нижняя зона соответствует АТР, верхняя зона – UTP.
На рисунке 3 видно нарастание интенсивности окрашивания верхней зоны (слева направо) и уменьшение интенсивности окрашивания нижней зоны (слева направо). Радиоактивность каждой зоны соответствует количеству АТР и UTP в анализируемой аликвоте. Отношение количества радиоактивности в зонах UTP к АТР позволяет рассчитать глубины прохождения реакции, т.е. долю АТР, которая была израсходована за время реакции:
% = UTP x 100%
UTP+ATP
Для каждой аликвоты доля израсходованного в реакции АТР умножается на 2x10–9 моль и делится на 15 (время ферментативной реакции). В результате получается количество АТР в минутах, которое было израсходовано в реакции исследуемого образца. Перерасчитываем на разведение от исходного объема и делим активность на количество (массу) изначального материала (энуклеированного глаза). Получается удельная активность фермента NDPk, т.е. ферментативная активность 1 мг ткани исследуемых образцов.
Результаты и обсуждение. При проведении серии биохимических исследований были получены результаты активности NDPk при трофической МЛЦК активности NDPk в контрольной группе. Был проведен анализ полученных данных.
При трофической МЛЦК активность NDPk стабильна в пределах 13,32–13,39 микроединиц активности в первый час, 3 и 6 ч после воздействия полупроводниковым диодным лазером, далее прослеживается динамика роста активности NDPk с 6–го ч после воздействия. Активность NDPk нарастает в течение последующих 9 ч и достигает максимума (19,41 микроединиц активности) к 18–ти часам от момента воздействия лазера. В течение полутора суток активность NDPk остается максимально высокой. Далее, к началу вторых суток исследования активность NDPk постепенно уменьшается до 18,85 микроединиц активности.
В контрольной группе активность NDPk стабильна в пределах 13,31–13,41 микроединиц активности (рис. 2).
Выводы
На основании проведенных экспериментальных исследований доказано повышение активности NDPk в опытной группе по сравнению с контролем, что служит подтверждением на биохимическом уровне эффективности МЛЦК в плане активизации обменных процессов глаза.
Полученные данные позволяют продолжить изучение биохимических процессов, происходящих в глазу после лазерной циклокоагуляции, и перейти к дальнейшему изучению собственных биологически активных веществ, благотворно влияющих на уровень метаболизма.
Литература
1. Нестеров А. П., Глаукомная оптическая нейропатия. Вестник офтальмологии. 1999; 115 (4): 3–6.
2. Нестеров А.П., Егоров Е.А., Егоров А.Е., Кац Д.В., Алябьева Ж.Ю., Касимов Э.М. Влияние транссклеральной лазерной циклокоагуляции на внутриглазное давление и зрителные функции у больных глаукомой с низким давлением. Клиническая офтальмология. 2001; 2: 56.
3. Нестеров А. П., Глаукома, МИА, 2008, 357.
4. Егоров А.Е., Егоров Е.А., Нестеров А.П,, Свирин А.В. Ограниченное и контролируемое воспаление как метод лечения ишемических и гипоксических заболеваний заднего сегмента глаза Российский медицинский журнал 2002; 1:3–6
5. Каламкаров Г.Р., Лунгина О.Г. Сенсорные системы. 2001; 15 (4): 275–287.
6. Бурсов И.В. Патофизиология и биохимия глаза. 1986, 73–76.
7. Мусил Я. Основы биохимии патологических процессов. Москва, Медицина, 1985.
8. Северин Е.С. Элементы патологической физиологии и биохимии. Москва, Изд–во МГУ, 1997, с. 150.
9. Бунин А.Я. Метаболические факторы патогенеза первичной открытоугольной глаукомы. Глаукома на рубеже тысячелетий. Мат. всероссийской науч.–практ. конференции. Москва,. 1999, с. 9–12
10. Алексеев В.Н., Мартынова Е.Б., Садков В.И., Самусенко И.А.Роль апоптоза и метаболизма мюллеровских клеток при экспериментальной глаукоме. Российский медицинский журнал. 2005; (2): 52–55.
11. Курышева Н.И. Глакомная оптическая нейропатия. Москва, 2006, 135.
12. Мазуш Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2–х томах. Москва, Мир, 1993, 384.
13. Егоров А.Е., Егоров Е.А., Нестеров А.П,, Свирин А.В. Ограниченное и конралируцемое воспаление как метод лечения ишемических и гипоксических заболеваний заднего сегмента глаза. Российский медицинский журнал 2002; 1:3–6
14. Егоров Е.А., Курмангалиева М.М., Федотовских Г.В. Морфологическое исследование сетчатки глаз больных глаукомой. Российский медицинский журнал 2004; 2: 54–56.
15. Johnson EC, Deppmeier LM, Wentzien SK, et al. Chronology of optic nerve head and retinal responses to elevated intraocular pressure. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41: 431–442.
16. Morgan JE. Optic nerve head structure in glaucoma: astrocytes as mediators of axonal damage. Eye 2000; 14: 437–444.
17. Morrison J., Johnson E., Cepurna W. Understanding mechanisms of pressure–induced optic nerve damage Progress in Retina and Eye Research. 2005; 24: 217–240.
