Нейропротекторную терапию применяют для лечения глазного ишемического синдрома (сосудистая патология органа зрения, обусловленная нарушением кровообращения в системе внутренней сонной и глазничной артерий). По течению выделяют острый тип, к которому относят окклюзию и спазм центральной артерии сетчатки и ее ветвей, и хронический тип течения, к которому относят диабетическую ретинопатию, гипертоническую ретинопатию, первичную глаукому и ряд других заболеваний.
В течение многих лет для лечения глазного ишемического синдрома применяют 1% раствор эмоксипина. Он относится к классу 3-оксипиридинов и обладает антиоксидантным, антиагрегационным, эндотелиотропным и ретинопротекторным свойствами.
Изучение возможности применения нейропептидов в офтальмологии началось в 1987 году.
Нейропептиды являются щелочными полипептидами, имеющими молекулярную массу от 1 000 до 10 000 Да. Их получают из тканей сетчатки и головного мозга с помощью метода кислотной экстракции с последующей очисткой от балластных веществ. Данный метод получения исключает возможность переноса вирусов и протоонкогенов, что обеспечивает безопасность применения данных веществ в клинической практике.
Нейропептиды обладают способностью индуцировать процессы специфической дифференцировки в популяции клеток, являющихся исходным материалом для их получения.
Они влияют на клеточный и гуморальный иммунитет, состояние системы гомеостаза, перекисное окисление липидов и другие защитные реакции организма. Это действие выражено в разной степени и зависит от применяемой дозы.
Механизм действия нейропептидов в настоящее время не до конца ясен. По всей видимости, их эффекты осуществляются через специфические рецепторы, расположенные на поверхности клетки. После экзогенного введения полипептидов происходит выброс эндогенных регуляторных пептидов, для которых введенный пептид является индуктором. Эффект пептидного каскада приводит к пролонгированию эффекта нейропептидов, который сохраняется даже после полного разрушения первоначального индуктора.
В настоящее время используются такие нейропептиды, как ретиналамин и кортексин.
Целью исследования было сравнить выраженность нейропротекторных свойств эмоксипина и ретиналамина.
Материалы и методы
Изучение нейропротекторного эффекта исследуемых препаратов включало исследование динамики электрофизиологических и морфологических параметров сетчатки на фоне циркуляторной гипоксии тканей сетчатки без использования нейропротекторов и после их применения. Исследование было проведено у 10 кроликов (20 глаз) породы шиншилла весом 3 кг. Модель циркуляторной гипоксии создавали путем наложения двух лигатур на обе общие сонные артерии.
Электрофизиологические параметры (ГФ-ЭРГ и ЗВКП) регистрировались в стандартных условиях с помощью программы, разработанной фирмой «МБН». Регистрация осуществлялась до перевязки общих сонных артерий и далее каждые 30 минут в течение 5 часов. Затем глазные яблоки удаляли и проводили морфометрический анализ ткани сетчатки.
Для исследования морфологических изменений нейронов сетчатки и их количественных показателей глазные яблоки животных фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида на фосфатном буфере (pH = 7,4). Затем выделяли заднюю стенку глаза. Экспериментальный материал обрабатывали 2% раствором четырехосмия на фосфатном буфере (pH = 7,4). После обезвоживания в спиртах восходящей крепости объект заливали в Эпон-Аралдит. Для проведения световой микроскопии с каждого блока готовили полутонкие срезы (1 мкм), которые окрашивали толуоидиновым синим по Нисслю в модификации Ромейса. Выбор указанного метода окраски позволяет получить четкую картину морфологических изменений, как со стороны нейронов так и со стороны клеток глии, сосудов, а также делает возможным обнаружить признаки воспаления.
Оценку состояния ганглионарных клеток производили следующим образом.
На первом этапе в пределах изучаемых срезов в 10 полях зрения подсчитывали общее число ганглионарных клеток с хорошо контурируемыми ядрами. Далее вычисляли среднюю величину, характеризующую число сохранных ганглионарных клеток в 1 поле зрения, для данной группы животных.
Затем на каждые 200 исследуемых клеток в переделах изучаемого среза вели подсчет пораженных нейронов, выделяя среди них четыре группы:
- отсутствующий нейрон (ОН) - в зоне погибшего нейрона наблюдалось скопление глии;
- грубо измененный нейрон (ГН) - дегидратированный и атрофичный нейрон;
- слабо измененный нейрон (СН) - нейрон с сохраненным ядром, но с изменениями в цитоплазме (набухание, гиперхроматоз, хроматолиз);
- неизмененный нейрон (НН) - нормальный нейрон.
Далее вычисляли среднюю величину, характеризующую число ганглионарных нейронов с различной степенью поражения, для данной группы животных.
Полученные данные о количестве ганглионарных нейронов с различной степенью поражения использовали для определения тяжести (ТП), объема (ОП) и степени (СП) поражения. Эти величины вычисляли, используя следующие формулы:
В ходе исследования животные были разделены на
3 группы: 1 группа (контроль) включала 4 кролика (8 глаз), у которых исследовалась динамика ГФ-ЭРГ и ЗВКП на фоне циркуляторной гипоксии тканей сетчатки без использования нейроретинопротекторов.
Во второй группе (3 кролика - (6 глаз)) изменение показателей оценивалась на фоне парабульбарного введения 1% раствора эмоксипина, который вводили три раза с интервалом 1,5 часа (сразу после перевязки сосудов, а также через 90 и 180 минут после начала эксперимента).
У 3 кроликов (6 глаз) третьей группы использовали раствор ретиналамина, который вводили парабульбарно однократно перед перевязкой сосудов в объеме 0,2 мл.
Результаты исследования
Сравнение изменения амплитуды а-волны ГФ-ЭРГ у кроликов первой и второй групп показывает, что в отличие от группы контроля значительного снижения данного параметра во второй группе не наблюдалась. Кроме того, через 120 минут после начала исследования наблюдалось повышения амплитуды а-волны ГФ-ЭРГ выше исходного уровня. Через 210 минут после начала эксперимента наблюдалось повышение амплитуды до исходного уровня после резкого падение, отмеченного на 150 и 180 минутах после перевязки сосудов. В среднем величина амплитуды а-волны ГФ-ЭРГ во второй группе превышала аналогичный показатель в контрольной группе на 14,48%.
Аналогичные результаты были получены при сравнении динамики в-волны ГФ-ЭРГ в первой и второй группах. Следует отметить, что сохранение амплитуды в-волны ГФ-ЭРГ во второй группе было более значительным. В среднем величина амплитуды в-волны ГФ-ЭРГ во второй группе превышала аналогичный показатель в контрольной на 25,14%. Как и в случае амплитуды а-волны, во второй группе наблюдалось несколько пиков повышения амплитуды в-волны ГФ-ЭРГ (через 60, 120 и 210 мин после применения эмоксипина).
Сравнение изменения амплитуды P100 ЗВКП в обеих группах показывает, что в отличие от группы контроля во второй группе в течение первых 150 минут исследования снижение амплитуды было менее выраженным. В сроки, превышающие 150 минут, снижение амплитуды P100 ЗВКП происходило одинаково в обеих группах. В среднем величина амплитуды P100 ЗВКП в течение исследования во второй группе превышала аналогичный показатель в контрольной группе на 6,85%. Изменение латентности P100 ЗВКП во второй и контрольной группах имело идентичный характер.
Сравнение изменения амплитуды а-волны ГФ-ЭРГ в первой и третьей группах показывает, что угасание амплитуды в опытной группе происходило медленнее. В среднем величина амплитуды а-волны ГФ-ЭРГ в третьей группе превышала аналогичный показатель в контрольной на 14,2%. Кроме того, через 150 минут после начала исследования, а также в самом конце наблюдения (270 и 300 мин) в третьей группе наблюдалось увеличение амплитуды а-волны ГФ-ЭРГ.
Аналогичные результаты были получены при сравнении динамики в-волны ГФ-ЭРГ в первой и третьей группах. Следует отметить, что сохранение амплитуды в-волны ГФ-ЭРГ по сравнению с динамикой а-волны в третьей группе было более значительным. В среднем величина амплитуды в-волны ГФ-ЭРГ в третьей группе превышала аналогичный показатель в контрольной на 20,4%. Как и в случае амплитуды а-волны, в третьей группе наблюдалось два пика повышения показателя (через 150 и 270 - 300 мин после применения препарата), которое было более значимым, чем в случае изменения амплитуды а-волны ГФ-ЭРГ.
Сравнение изменения амплитуды P100 ЗВКП в первой и третьей группах показывает, что в отличие от группы контроля в третьей группе в течение первых 180 минут исследования среднее значение амплитуды соответствовало исходной величине. Снижение амплитуды в третьей группе наблюдалось только в сроки, превышающие 180 минут. В среднем величина амплитуды P100 ЗВКП в третьей группе превышала аналогичный показатель в контрольной группе на 28,23%. Изменение латентности P100 ЗВКП в третьей и контрольной группах имело идентичный характер.
Полученные значения в выборке соответствовали нормальному распределению. Для оценки достоверности полученных результатов в каждой группе использовали критерий Ньюмена - Кейлса. Полученные результаты были статистически достоверны (уровень значимости (a< 0,05). Для оценки достоверности различия результатов, полученных в опытных группах, по сравнению с контрольной группой использовали критерий Даннета. Выявленные в ходе исследования отличия изменения амплитуды обеих волн ГФ-ЭРГ и амплитуды P100 ЗВКП были статистически достоверны (уровень значимости (a< 0,05). При этом в отношении латентности статистическая достоверность отличия результатов в опытной и контрольной группах отсутствовала (уровень значимости (a< 0,5).
По данным светового исследования изменения различных компонентов сетчатки в контрольной группе животных имели следующие особенности (рис.1). Толщина пигментного слоя была значительно уменьшена, при этом прослеживались участки полного истончения и незначительные по размерам зоны пролиферации. Изменения со стороны ядерных слоев проявлялись в уменьшении их толщины и отека экстацеллюлярного матрикса (ЭЦМ). Наибольшие изменения были выявлены в фоторецепторах, амакриновых и горизонтальных нейронах. Биполярные нейроны выглядели более сохранными.
Изменения со стороны сетчатых слоев были связаны с отеком ЭЦМ, резким истончением, особенно наружного сетчатого слоя (НСС), и разрушением фотосенсорного слоя в области прилегания к пигментному эпителию.
Наблюдалось значительное снижение количества ганглионарных клеток, в среднем их число составило 19±12,2. При этом соотношение между грубо измененными нейронами и отсутствующими нейронами склонялось в пользу последнего вида нейронов. Тяжесть, объем и степень поражения составили 100%.
Кроме того, дегенеративные изменения захватывали нейроглию, что выражалось в гибели Мюллеровых клеток.
В сосудистой оболочке наблюдался гемостаз и выраженная дилатация сосудов различного калибра.
У животных, которым парабульбарно вводили 1% раствор эмоксипина, в отличие от группы контроля наблюдались менее выраженные изменения ядерных и сетчатых слоев (рис. 2 - 3). Среди биполярных нейронов были выявлены 2-х ядрышковые клетки. Согласно данным Ярыгина В.Н. 2-х ядерные нейроны являются проявлением гипертрофии сохраненных нейронов, которые берут на себя функциональную нагрузку погибших нейронов. Количество сохранных ганглионарных нейронов превышает группу контроля - в среднем, их число составило 65±18,3. Среди измененных нейронов преобладали грубо измененные нейроны. В отличие от группы контроля, были выявлены слабоизмененные нейроны. Количество отсутствующих нейронов по сравнению с группой контроля значительно уменьшилось. Тяжесть поражения составила 88,3±6,0%. Объем поражения был таким же, как и в группе контроля. Степень поражения была равна 94,15±3,04%.
У животных на фоне применения ретиналамина сохранение клеточных элементов сетчатки было более выраженным (рис. 4 и рис. 5). Это касалось прежде всего слоя пигментного эпителия и внутреннего ядерного слоя. Количество многоядерных нейронов было более выраженным. Наблюдалось значительное колебание количества сохранных ганглионарных нейронов в различных полях зрения. В среднем оно составило 38,1±21,6. Следует отметить, что у животных этой группы впервые были выявлены неизмененные нейроны. Тяжесть поражения составила 83,5±9,1%. Объем поражения - 96,7±0,26. Степень поражения была равна 94,85±3,48%.
Следует отметить, что на фоне применения исследуемых препаратов изменений нейроглии выявлено не было. Кроме того, изменения отсутствовали в хориокапиллярном слое. Явления гемостаза и дилатации сосудов в сосудистой пластинке хориоидеи были слабо выражены.
Полученные данные о количестве ганглионарных нейронов не подчинялись законам нормального распределения, поэтому для оценки достоверности межгрупповых различий использовали критерий Крускала-Уоллиса. Межгрупповое различие было статистически достоверным (уровень значимости (a< 0,05).
Выводы
По данным электрофизиологического исследования и световой микроскопии ткани сетчатки выраженность нейропротекторного эффекта исследуемых препаратов практически равнозначна. Однако нейропрортекторный эффект ретиналамина более продолжителен. Кроме того, имеет место активизация собственных защитных механизмов организма на фоне применения ретиналамина, которая проявляется в улучшении электрофизиологических параметров в конце периода наблюдения.