ДНК в плазме (сыворотке)
крови человека
Впервые ДНК в образцах плазмы крови здоровых доноров была обнаружена еще в 1948 г. [16]. Среднее содержание суммы ДНК и РНК в 10 образцах составила 5,4 мкг/мл, отдельно концентрация ДНК не определялась. Современные исследования дают цифры содержания цДНК порядка единиц и десятков нг/мл. Так, Власов с соавт. [30] указывают, что содержание в плазме крови здоровых людей циркулирующих свободных молекул ДНК составляет от 1,8 до 35 нг/мл, а Леон с соавт. [14] предлагают считать нормальным диапазоном концентраций цДНК 0–50 нг/мл. Примеры определения уровня цДНК у здоровых людей суммированы в таблице 1. Однако надо иметь в виду, что получаемые величины могут сильно отличаться в зависимости от используемых методов выделения и детекции ДНК. Так, просто использование двух разных методов выделения цДНК из одних и тех же образцов плазмы может приводить к результатам, отличающимся в 1,9–5,2 раза [18].
Низкий уровень циркулирующих нуклеиновых кислот, по логике вещей, должен поддерживаться нуклеазами, однако содержание ДНК–азы I в плазме 3,2–18,4 нг/мл, что кажется недостаточным для эффективного контроля [30]. Видимо, у здоровых людей низкое содержание циркулирующей ДНК может поддерживаться при участии ДНК–азы периферических сосудов.
Начиная с работы Тана с соавт. [27], опубликованной в 1966 г., многие исследователи изучали возможность использования цДНК в качестве биомаркера при самых разнообразных заболеваниях – системной красной волчанке, инфаркте миокарда, преэклампсии, инсульте, синдроме Дауна и т.д. [15,28]. С 1977 г., после публикации работы [14], особенно интенсивно развиваются исследования применимости цДНК в лабораторной медицине онкологических заболеваний.
Источники циркулирующей ДНК
Три основных процесса могут приводить к появлению в крови цДНК клеток организма: (1) некроз клеток, например лейкоцитов; (2) апоптоз клеток, в т.ч. опухолевых; (3) высвобождение ДНК из неповрежденных клеток (как нормальных, так и опухолевых). Важно отметить значимость последнего источника цДНК. В свое время было убедительно продемонстрировано, что ни апоптозом, ни некрозом нельзя полностью объяснить присутствие ДНК в плазме крови [7,26]. По–видимому, лишь незначительные или следовые количества цДНК могут иметь происхождение из некротизированных клеток. В то же время существенная часть цДНК представлена двухцепочечными молекулами длиной от 180 до 1000 пар нуклеотидов (пн), что весьма характерно для фрагментов, образующихся в процессе развития апоптоза клеток [9,11].
С другой стороны, достаточно давно известно, что в культуре как нормальные, так и трансформированные клетки способны выделять и ДНК, и РНК в окружающую среду [6,13]. Интересно, что преимущественно вовне выделяются только что синтезированные молекулы нуклеиновых кислот, причем часть из них секретируется в виде нуклеопротеинов или в форме гетеродуплексов ДНК–РНК [23]. В сыворотке крови человека по крайней мере часть молекул цДНК присутствует также в форме аналогичных нуклеопротеинов или комплексов с РНК [22]. В настоящее время происхождение части цДНК в плазме (сыворотке) крови человека путем высвобождения из живых клеток не вызывает сомнения [26].
Опухолевая ДНК
в плазме (сыворотке) крови
Содержание цДНК в плазме (сыворотке) крови пациентов, страдающих от онкологических заболеваний, подвержена очень высокой вариабельности. В разных исследованиях была обнаружена неодинаковая распространенность повышенных уровней цДНК у пациентов с раковыми заболеваниями: 27% [24], 50% [14], 66% [21]. При этом при одних формах рака содержание цДНК обычно было выше, чем у здоровых доноров, при других, например раке легких, обычно укладывалось в пределы нормы (табл. 2). Проведение курса радиотерапии приводило к значительному снижению содержания цДНК у 66–90% пациентов с лимфомами, раком легких, яичников, матки и цервикальными опухолями и лишь у 16–33% пациентов с глиомой, колоректальными опухолями или раком молочной железы [14]. Таким образом, кажется, что определение цДНК может быть хорошим маркером онкологических заболеваний. Однако при этом важно помнить, что повышение уровня цДНК не является специфичным именно для рака, а может наблюдаться и при ряде иных заболеваний человека.
Как же выяснить, является ли присутствующая в плазме (сыворотке) крови цДНК опухолевой? Принципиально можно предложить четыре основных подхода: (1) выявление ДНК со сниженной стабильностью цепей, характерной для опухолевой ДНК; (2) обнаружение маркеров специфических онкогенов; (3) обнаружение специфических мутаций опухолевых супрессоров в цДНК; (4) выявление специфических микросателлитных маркеров [7].
Оценка нестабильности цепей была первым методом, позволившим обнаружить в плазме крови цДНК специфически опухолевого происхождения [25], однако эти исследования были выполнены на ограниченной группе пациентов (37 человек). Этот метод, сыгравший такую важную роль на начальном этапе исследований, сейчас представляет небольшой интерес, поскольку снижение стабильности молекул цДНК не является признаком, абсолютным только для опухолевых заболеваний. Аналогично неспецифичной оказалась и повышенная устойчивость опухолевой ДНК к некоторым видам ДНК–аз.
Онкогены представляют собой гены, белковые продукты которых могут приводить к опухолевой трансформации клеток сами по себе или в комбинации с другими факторами [1]. Известно несколько десятков онкогенов, которые обычно ассоциированы с определенными формами опухолей. Так, специфические точечные мутации в генах семейства ras были выявлены в цДНК от пациентов с гематопоэтическими опухолями, колоректальным раком и раком поджелудочной железы, причем в некоторых случаях еще до появления клинических признаков заболевания [7].
Опухолевые супрессоры в норме кодируют белки, предотвращающие неконтролируемую пролиферацию клеток или вызывающие апоптоз в клетках с сильно поврежденным геномом. Инактивация этих механизмов в результате мутаций в генах опухолевых супрессоров ведет к автономной пролиферации как основному компоненту опухолевой трансформации и к увеличению генетической гетерогенности как необходимому условию последующей прогрессии опухоли. Чаще всего мутации затрагивают такой ген опухолевого супрессора, как p53 [1].
Микросателлиты в эукариотическом геноме представляют собой множественные (часто – более сотни) повторы очень коротких (из 2–6 нуклеотидов) участков последовательности ДНК. Микросателлиты более или менее случайно разбросаны по геному, проявляют заметную нестабильность и могут легко мутировать, изменяя число своих повторов в геноме [2]. Определенные формы микросателлитной нестабильности, – например утрата генетической гетерозиготности (Loss of Heterozygosity – LOH), т.е. утрата участка хромосомы, несущей соответствующий аллель, или, наоборот, появление новых аллелей, – могут встречаться в цДНК пациентов с опухолями головы, шеи, легких и почек [7].
Наиболее чувствительным является определение различных классов генетических опухолевых маркеров. Например, Силва с соавт. обнаружили, что у 66% пациенток с раком молочной железы цДНК содержит по крайней мере одну из микросателлитных мутаций, или участки избыточного метилирования гена опухолевого супрессора p53, или аберрантное метилирование в гене p16INK4a [21]. Различное сочетание микросателлитных маркеров, онкогенов и изменений в генах опухолевых супрессоров являются полиморфными маркерами самых разнообразных вариантов рака: поджелудочной железы, толстого кишечника, молочной железы, печени, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легких, миелодиспластического синдрома, карциномы головы, шеи и почек. Таким образом, легко видеть, что выделенная из плазмы или сыворотки крови цДНК может быть ценным материалом для обнаружения генетических маркеров опухолей без проведения биопсии и даже без обнаружения локализации самой опухоли.
Инвазия и метастазирование
опухолей и циркулирующая ДНК
Как известно, процессы быстрого инвазивного роста и метастазирования злокачественных опухолей сопровождаются интенсивным разрушением тканей, окружающих опухоль и(или) расположенных в месте образования метастазов. Разрушение нормальных клеток может идти как путем некроза, так и апоптоза, индуцируемого, в частности, секретируемыми опухолевыми клетками биорегуляторами [17,32]. Вероятно, в роли такого биорегулятора может выступать и выделяемая опухолью ДНК. Во всяком случае, ее уровень при некоторых формах рака имеет связь со степенью инвазивности и метастатической активности рака. Например, у пациенток с раком молочной железы высокая скорость роста карциномы протоков, высокий индекс пролиферации и метастазирование опухоли в лимфатические узлы коррелировали с более высоким уровнем цДНК плазмы крови [21].
В недавней статье было проведено исследование значимости определения апоптотического индекса (АИ) при инвазивном раке мочевого пузыря (РМП) (45 пациентов). АИ представляет собой показатель, характеризующий интенсивность появления в сыворотке крови цДНК в результате апоптоза клеток, и определяется как соотношение концентраций фрагментов ДНК, образование которых происходит преимущественно при апоптозе (PTGS2; 124 пн) и при некрозе (Reprimo; 271 пн) клеток. Для оценки концентраций использовали количественный ПЦР–анализ. Контрольной группой служили пациенты с доброкачественной гиперплазией простаты. Оказалось, что при раке повышается содержание как некротических, так и – в существенно большей степени?– апоптотических фрагментов ДНК. Следовательно, значение АИ также увеличивается. Хотя уровень цДНК и величина АИ не коррелировали с клинико–патологическими параметрами, тест определения АИ для диагностики инвазивного РМП характеризовался очень высокой чувствительностью (96%) и умеренной специфичностью (62%). Но особенно значимым оказался тот факт, что повышение АИ оказалось независимым прогностическим фактором смертности, специфически обусловленной развитием РМП [9].
Наличие в организме пациента метастазов первичной опухоли приводит к дополнительному повышению содержания цДНК в сыворотке крови: различия между пациентами с метастазами и без них были статистически достоверны [14]. В отношении метастазирования есть и еще один интересный момент. Существуют данные, что внеклеточная ДНК, выделенная одними клетками, может изменять метаболическое состояние и биологическую активность других клеток в организме [10]. Более того, известен следующий примечательный факт: ДНК, высвобождающаяся из культивируемых клеток лейкемии или глиомы, оказалась способной при добавлении к мышиным лимфоцитам усиливать включение радиоактивно меченного тимидина во вновь синтезируемую ДНК этих клеток [5]. Не значит ли это, что ДНК, секретированная опухолевыми клетками, способна стимулировать опухолевую трансформацию нормальных клеток или – по крайней мере – сенсибилизировать здоровые клетки к последующему онкогенезу? Не может ли такой бесклеточный механизм быть одним из путей метастазирования? Этот вопрос на сегодняшний день остается неразрешенным. Но, как бы то ни было, похоже, что метастатическая активность первичных опухолей и появление вторичных неопластических локусов достаточно тесно взаимосвязаны с повышенным уровнем цДНК в крови больного.
Заключение
Разумеется, в одной статье невозможно дать исчерпывающей информации о столь бурно развивающейся области исследований, но изложенное можно резюмировать следующим образом: в отношении рака использование анализа цДНК возможно для решения всех четырех задач лабораторной медицины – скрининга, диагностики, мониторинга и прогноза. Для скрининга можно использовать определение уровня цДНК. В области диагностики наилучших результатов можно достигнуть, используя тесты на обнаружение специфических опухолевых маркеров в молекулах цДНК. Оценка содержания цДНК и величины апоптотического индекса может помочь в прогнозе течения заболевания и в мониторинге эффективности лечения.
Таким образом, даже простое определение уровня цДНК способно в ряде случаев позволить заподозрить наличие опухолевого процесса или оценить степень его выраженности или риск метастазирования. Но еще важнее то, что использование цДНК, которая может быть получена из образцов плазмы или сыворотки крови пациентов, для проведения последующих чувствительных и специфичных тестов может сыграть важную роль в улучшении методов диагностики, мониторинга и прогноза течения заболевания у пациентов с различными формами рака. Особенно стоит подчеркнуть, что такие диагностические тесты могут быть не менее информативными, чем биопсия, но при этом исследование цДНК гораздо менее травматично, более просто и доступно и гораздо лучше подходит для оценки состояния пациента в динамике.
Литература
1. Абелев Г.И. На пути к пониманию природы рака / Г.И.Абелев, Т.Л.Эрайзер // Биохимия. 2008. Т.73, № 5. С. 605–618. http://garriabelev.narod.ru/bcmrrus.pdf
2. Животовский Л.А. Микросателлитная изменчивость в популяциях человека и методы ее изучения // Вестник ВОГиС. 2006. Т.10, № 1. С. 74–96. http://www.bionet.nsc.ru/vogis/pict_pdf/ 2006/t10_1/vogis_10_1_05.pdf
3. Пасечников В.Д. Эпидемиология рака желудка / В.Д.Пасечников, С.З.Чуков // Росс. ж. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. 2002. № 3. С.18–26.
4. Удовиченко И.В. Эпидемиология рака молочной железы в Челябинской области за период с 2001 по 2004 г. / И.В.Удовиченко, А.В.Важенин, С.А.Мальценва, Л.П.Кукленко, Т.В.Кукленко, Д.Н.Булынский // Сибирск. онкологич. ж. 2008. Прил. 2. С. 87–88.
5. Adams D.H. In vitro stimulation by tumour cell media of [3H]–thymidine incorporation by mouse spleen lymphocytes / D.H.Adams, N.Diaz, P.B.Gahan // Cell Biochem. Funct. 1997. V.15. P.?119–126.
6. Anker P. Spontaneous release of DNA by human blood lymphocytes as shown in an in vitro system / P.Anker, M.Stroun, P.Maurice // Cancer Res. 1975. V. 35. P. 2375–2382.
7. Anker P. Detection of circulating tumour DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients / P.Anker, H.Mulcahy, X.Q.Chen, M.Stroun // Cancer Metastasis Rev. 1999. V. 18. P. 65–73.
8. Chen Y.–C. Molecular epidemiology of cancer / Y.–C.Chen, D.J.Hunter // CA Cancer J. Clin. 2005. V. 55. P. 45–54.
9. Ellinger J. Apoptotic DNA fragments in serum of patients with muscle invasive bladder cancer: A prognostic entity / J.Ellinger, P.Bastian, N.Ellinger, P.Kahl, F.Perabo, R.Buttner, S.Muller, A.Ruecker // Cancer Lett. 2008. V. 264. P. 274–280.
10. Gahan P.B. Circulating DNA: Intracellular and intraorgan messenger? // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006. V. 1075. P. 21–33.
11. Herrmann M. A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments / M.Herrmann, H.M.Lorenz, R.Voll, M.Grunke, W.Woith, J.R.Kalden // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 5506–5507.
12. Klemp P. Measurement of plasma DNA by a physiochemical method: relevance in SLE / P.Klemp, O.L.Meyers, E.H.Harley // Ann Rheum. Dis. 1981. V. 40. P. 593–599.
13. Kolodny G. Secretion of RNA by normal and transformed cells / G.Kolodny, L.Culp, L.Rosenthal // Exp. Cell Res. 1972. V. 73. P. 65–72.
14. Leon S.A. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy / S.A.Leon, B.Shapiro, D.M.Sklaroff, M.J.Yaros // Cancer Res. 1977. V. 37. P. 646–650.
15. Lui Y.Y. Circulating DNA in plasma and serum: biology, preanalytical issues and diagnostic applications / Y.Y.Lui, Y.M.Dennis // Clin. Chem. Lab. Med. 2002. V. 40. P. 962–968.
16. Mandel P. Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l’homme / P.Mandel, P.Metais // C. R. Acad. Sci. Paris. 1948. V. 142. P. 241–243.
17. Mareel M. Clinical, cellular, and molecular aspects of cancer invasion / M.Mareel, A.Leroy // Physiol. Rev. 2003. V. 83. P. 337–376.
18. Schmidt B. Improved method for isolating cell–free DNA / B.Schmidt, S.Weickmann, C.Witt, M.Fleischhacker // Clin. Chem. 2005. V. 51. P. 1561–1563.
19. Schottenfeld D. Cancer Epidemiology and Prevention / Ed. by D.Schottenfeld, J.F.Fraumeni. NY: Oxford University Press, 2008. 1544 pp.
20. Shapiro B. Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease / B.Shapiro, M.Chakrabarty, E.M.Cohn, S.A.Leon // Cancer (Phila.). 1983. V. 51. P.?2116–2120.
21. Silva J.M. Presence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients: clinicopathological correlations / J.M.Silva, G.Dominguez, J.M.Garcia, R.Gonzalez, M.J.Villanueva, F.Navarro, M.Provencio, S.San Martin, P.Espana, F.Bonilla // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 3251–3256.
22. Sisco K.L. Is RNA in serum bound to nucleoprotein complexes? // Clin. Chem. 2001. V. 47. P.?1744–1745.
23. Stroun M. Presence of RNA in the nucleoprotein complex spontaneously released by human lymphocytes and frog auricles in culture / M.Stroun, P.Anker, M.Beljanski, J.Henri, C.Lederrey, M.Ojha, P.A.Maurice // Cancer Res. 1978. V. 38. P. 3546–3554.
24. Stroun M. Isolation and characterization of DNA from the plasma of cancer patients / M.Stroun, P.Anker, J.Lyautey, C.Lederrey, P.A.Maurice // Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1987. V. 23. P. 707–712.
25. Stroun M. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients / M.Stroun, P.Anker, P.Maurice, J.Lyautey, C.Lederrey, M.Beljanski // Oncology. 1989. V. 46. P.?318–322.
26. Stroun M. The origin and mechanism of circulating DNA / M.Stroun, P.Maurice, V.Vasioukhin, J.Lyautey, C.Lederrey, F.Lefort, A.Rossier, X.Q.Chen, P.Anker // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000. V. 906. P.?161–168.
27. Tan E.M. Deoxybonucleic acid (DNA) and antibodies to DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus / E.M.Tan, P.H.Schur, R.I.Carr, H.G.Kunkel // J. Clin. Invest. 1966. V. 45. P.?1732–1740.
28. Tsang J.C. Circulating nucleic acids in plasma/serum / J.C.Tsang, Y.M.Lo // Pathology. 2007. V.?39. P. 197–207.
29. Vineis P. Molecular epidemiology and biomarkers in etiologic cancer research: the new in light of the old / P.Vineis, F.Perera // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2007. V. 16. P. 1954–1965.
30. Vlassov V.V. Extracellular nucleic acids / V.V.Vlassov, P.P.Laktionov, E.Y.Rykova // Bioessays. 2007. V. 29. P. 654–667.
31. WHO. World Cancer Report 2008. World Health Organisation. 208. 510 pp.
32. Wittekind C. Cancer invasion and metastasis / C.Wittekind, M.Neid // Oncology. 2005. V. 69, Suppl.1. P. 14–16.
