Введение
Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa являются опасными оппортунистическими патогенами — актуальными возбудителями инфекций, связанными с оказанием медицинской помощи, что обусловливает повышенное внимание к их изучению со стороны научного сообщества [1–5]. Так, по данным российского эпидемиологического многоцентрового исследования «МАРАФОН», в 17,4% случаев возбудителями госпитальных инфекций являются штаммы P. aeruginosa [3]. Согласно сведениям, представленным на онлайн-платформе AMRmap, созданной для анализа данных о резистентности бактерий к антимикробным препаратам в России [5], по состоянию на 2020 г. штаммы P. aeruginosa являются возбудителями нозокомиальных инфекций в 18,6% случаев.
Известно, что штаммы P. aeruginosa часто выявляются при сепсисе (20%), вентилятор-ассоциированных пневмониях (45%), инфекциях мочевыводящих путей (10%), интраабдоминальных инфекциях (28%), ожоговых и раневых инфекциях (17%), хронических респираторных инфекциях у пациентов с муковисцидозом (70%) [1–4]. Особую настороженность вызывают случаи инфекций кровотока и центральной нервной системы, вызванных полирезистентными штаммами P. aeruginosa, в связи с высокими показателями смертности (до 28%) и затратами на лечение [6, 7].
В формировании эпидемически значимых клонов P. аeruginosa большое значение имеют такие свойства возбудителя, как высокий адаптивный потенциал, пластичность генома, наличие широкого спектра детерминант патогенности и природной устойчивости к антибактериальным препаратам различных классов: цефалоспоринам, аминогликозидам, фторхинолонам [1, 2, 4]. Последнее обусловливает применение карбапенемов в качестве основного средства антибиотикотерапии инфекций, вызванных синегнойной палочкой.
В последние годы наблюдается рост числа штаммов P. aeruginosa с множественной и экстремальной лекарственной устойчивостью, что связано с накоплением мутаций в хромосомных генах, а также распространением генов металло-β-лактамаз (МБЛ) и β-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), локализованных на мобильных элементах [1–4]. По данным разных авторов, устойчивостью к карбапенемам обладали 13,87% штаммов P. aeruginosa, выделенных из мокроты [8], 50% нозокомиальных штаммов [4, 9] и до 70% штаммов из крови и ликвора [6, 7]. Это свидетельствует о необходимости динамического мониторинга за механизмами устойчивости бактерий данного вида с целью обеспечения эффективной терапии противомикробными препаратами.
С целью эпидмаркирования клинических штаммов P. aeruginosa используется схема молекулярного сиквенс-типирования (Multilocus Sequence Typing — MLST), основанная на анализе нуклеотидной последовательности генов «домашнего хозяйства» (acsA, aroE, guaA, mutL, nuoD, ppsA и trpE). С помощью данной схемы были определены доминирующие сиквенс-типы, которые сформировали группу международных «клонов высокого риска», к ним относятся сиквенс-типы 111, 175, 233, 235, 277, 357, 654 и 773 [1, 2, 4]. Отличительной особенностью данных сиквенс-типов является присутствие в геноме приобретенных генов БЛРС и карбапенемаз, включая МБЛ [1–4, 6–10].
В клинической практике для определения генов карбапенемаз используются коммерческие ПЦР тест-системы (например, «АмплиСенс® MDR MBL-FL»), градиентные тест-полоски (Etests MBL IP/IPI, BioMerieux, Франция) и др. Однако данные методы не позволяют в полной мере оценить весь спектр генетических механизмов, вовлеченных в формирование устойчивости к антимикробным препаратам.
Применение современных технологий высокопроизводительного секвенирования и биоинформатического анализа позволяет проводить расширенное эпидмаркирование карбапенем-резистентных штаммов P. aeruginosa, имеющее большое значение для эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи.
Цель исследования — оценка механизмов устойчивости к антимикробным препаратам клинических штаммов P. aeruginosa.
Материал и методы
Объектом исследования являлись 6 клинических штаммов P. aeruginosa, выделенных из раневого отделяемого у пациентов с ожоговой травмой, находящихся на стационарном лечении в медицинских организациях г. Нижнего Новгорода. Все штаммы характеризовались устойчивостью к карбапенемам (имипенему, дорипенему, меропенему). Полногеномное секвенирование проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) с набором MiSeq Reagent kit v3 (150 циклов). Выравнивание и cборку нуклеотидных последовательностей de novo осуществляли с помощью программы SPAdes, версия 3.9.1. Аннотирование проводили с использованием Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok). Для определения сиквенс-типа штаммов P. aeruginosa по схеме Multilocus Sequence Typing (MLST) использовали поисковый сервис базы данных Pseudomonas aeruginosa typing database (https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_paeruginosa_seqdef). С помощью веб-сервиса Resistance Gene Identifier — RGI (https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi) базы данных The Comprehensive Antibiotic Resistance Database — CARD (https://card.mcmaster.ca/home) проводили определение генетических детерминант резистентности. Поиск гомологичных последовательностей, депонированных в базе данных GenBank, осуществляли с использованием сервиса BLASTN (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Web-сервисы ICEfinder (https://bioinfo-mml.sjtu.edu.cn/ICEfinder/index.php), IS-finder (https://www-is.biotoul.fr/), VRprofile2 (https://tool2-mml.sjtu.edu.cn/VRprofile/home.php) использовали для поиска и характеристики мобильных элементов.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования позволили определить детерминанты резистентности (см. таблицу).
Согласно результатам типирования по схеме MLST установлено, что все исследуемые штаммы псевдомонад принадлежат к эпидемически значимым сиквенс-типам, имеющим глобальное распространение, представители сиквенс-типа 235 занимают лидирующие позиции по всему миру [10]. Штаммы P. aeruginosa, принадлежащие ST357, являются наиболее распространенными в Азии [10], а штаммы сиквенс-типа 654 имеют более широкое распространение на территории России (их доля достигает 24%) [11] по сравнению со странами Европы [10].
Сравнительный анализ структуры резистома показал, что общими для всех исследуемых штаммов P. aeruginosa являются гены β-лактамаз молекулярного класса С (PDC) и класса D (OXA-50-подобные), а также гены хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (catB7), фосфомицин-тиол-трансферазы (fosA), аминогликозид-фосфотрансферазы (aph(3’)-IIb).
С помощью сервиса VRprofile2 и IS-finder у исследуемых штаммов P. aeruginosa определены приобретенные детерминанты резистентности, которые связаны с мобильными структурами. В частности, у штаммов P. aeruginosa NNPs269 и NNPa50 гены clmA, acc(6’)-Ib (aacA4) и blaOXA-14 расположены в составе In998-подобного интегрона первого класса, отличие заключается в замене гена blaOXA-10 на blaOXA-14. БЛРС OXA-14 имеет аминокислотную замену G157D по сравнению с OXA-10, что обеспечивает ферментативную активность в отношении цефтазидима [12]. В результате поиска в базе данных GenBank идентичных последовательностей интегрона, несущих blaOXA-14, выявлено не было. Первый случай обнаружения (в Турции) штамма P. aeruginosa, продуцирующего β-лактамазу OXA-14, датируется 1991 г. [12]. У штамма P. aeruginosa NNPs269 определен ген аминогликозидаденилтрансферазы (aadA6) с последовательностью gcuD (orfD), кодирующей гипотетический белок. Штамм NNPs180 обладает In274-подобным интегроном (DQ899759.1), несущим гены aac(3’)-Ic и cmlA5, и дополнительную детерминанту smr, кодирующего белок семейства эффлюксных белков SMR. Также в структуре генома штамма NNPs180 определены кассетные гены aac(3)-Id-dfrB5-aac(6’)-Il. По данным литературы, у представителей сиквенс-типа 235 часто обнаруживается сходный по структуре интегрон 1-го типа — In559 (AM749810).
Ген МБЛ VIM-2 выявлен лишь у штамма P. aeruginosa NNPs244. Нужно отметить, что в геноме штамма NNPs244 присутствуют другие гены резистентности, которые сцеплены с мобильными элементами, в частности гены аминогликозидфосфотрансфераз (aph(6)-Id, aph(3’’)-Ib).
У штаммов NNPa51 и NNPa52 в структуре интегрона первого класса определены гены aac(6’)-I1, ant(2’’)-Ia, blaOXA-10, ant(3’’)-Ia. Различие между штаммами P. aeruginosa NNPa51 и NNPa52 наблюдается и в наличии генов, кодирующих аллельные варианты БЛРС — VEB, в частности VEB-14 и VEB-9 соответственно. Данные литературы свидетельствуют о широком распространении генов β-лактамазы VEB среди представителей сиквенс-типа 357, в первую очередь VEB-9 [13]. Факты обнаружения blaVEB-14 у представителей данного сиквенс-типа на настоящий момент в литературе не описаны.
Все исследуемые штаммы псевдомонад характеризуются наличием широкого разнообразия детерминант эффлюкс-систем, принадлежащих различным семействам (см. таблицу).
В ходе анализа нуклеотидной последовательности исследуемых штаммов были установлены изменения в структуре хромосомных генов, которые ассоциированы с формированием лекарственной устойчивости. В частности, у всех штаммов обнаружены мутации в структуре гена gyrA, сопровождающиеся аминокислотной заменой (T83I), что обусловливает снижение чувствительности к фторхинолонам, и в регуляторном гене nalC, приводящие к аминокислотным заменам (S209R, G71E). У штаммов псевдомонад сиквенс-типа ST235 выявлена дополнительная мутация в гене nalC, приводящая к замене E153Q. Известно, что данные мутации в гене nalC сопровождаются гиперэкспрессией эффлюксных белков MexAB-OprM, что увеличивает скорость выведения антибактериальных препаратов, включая карбапенемы, из клеток бактерий [14]. У 5 штаммов P. aeruginosa (кроме NNPa50) выявлена мутационная изменчивость нуклеотидной последовательности гена поринового белка OprD. Известно, что белок OprD ответственен за проницаемость имипенема внутрь бактериальной клетки [11]. По-видимому, комбинирование механизмов резистентности, обусловленных мутационными процессами в генах oprD и nalC, является ключевым фактором формирования устойчивости к карбапенемам исследуемых штаммов P. aeruginosa, не обладающих карбапенемазной активностью.
Заключение
Установлено, что исследуемые карбапенем-резистентные штаммы P. aeruginosa принадлежат к международным эпидемически значимым клональным линиям и характеризуются присутствием большого разнообразия детерминант резистентности к аминогликозидам и β-лактамам. Отмечены различия в наборе генов устойчивости между штаммами P. aeruginosa, принадлежащими к одному сиквенс-типу. Ген карбапенемазы VIM-2 определен только у представителя сиквенс-типа 654, остальные штаммы характеризовались присутствием генов БЛРС групп VEB-1 и OXA-10. Анализ структуры хромосомных генов показал, что устойчивость к карбапенемам штаммов P. aeruginosa, не обладающих карбапенемазной активностью, связана с комбинированием механизмов устойчивости, связанных с мутациями в структуре генов поринового OprD- и регуляторного NalC-белков.
Таким образом, получены новые знания о механизмах устойчивости клинических штаммов P. aeruginosa, принадлежащих к международным клонам «высокого риска», к антимикробным препаратам, включая карбапенемы. Применение высокопроизводительного секвенирования позволило получить детальную характеристику популяционной структуры карбапенем-устойчивых штаммов P. aeruginosa. Данная технология может стать одним из надежных методов молекулярной эпидемиологии в аспекте эпидемиологического маркирования возбудителей нозокомиальных инфекций. Источник финансирования
Работа выполнена в рамках государственного задания отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора на 2021–2025 гг. «Научное обеспечение эпидемиологического надзора и санитарной охраны территории Российской Федерации. Создание новых технологий, средств и методов контроля и профилактики инфекционных и паразитарных болезней» (п. 1.3.6.2, утв. приказом Роспотребнадзора от 24.12.2020 № 869).