Введение
Инфекция, вызванная новым коронавирусом SARS-CoV-2 (COVID-19), изначально рассматривалась как заболевание дыхательной системы, однако накопленные за последние годы данные свидетельствуют о ее мультисистемном характере. Так, помимо респираторных нарушений описана возможность вовлечения сердечно-сосудистой, нервной, мочевыделительной и эндокринной систем [1]. Актуальной представляется возможность повреждения эндокринного аппарата поджелудочной железы и развития нарушений углеводного обмена (НУО) в контексте постковидного синдрома [1–5]. Результаты систематических обзоров и метаанализов продемонстрировали повышение риска новых случаев сахарного диабета после перенесенного тяжелого COVID-19 [2–4], однако механизмы формирования НУО остаются предметом дискуссий. Среди возможных звеньев патогенеза рассматриваются прямое повреждение β-клеток поджелудочной железы вирусом SARS-CoV-2, опосредованное влияние системного воспаления, дисрегуляция ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, лекарственно-индуцированные эффекты, нарушение секреции адипоцитокинов, а также инсулинорезистентность [5].
Важным направлением исследований в последнее время является поиск молекулярных маркеров, отражающих воспалительные, стресс-индуцированные и метаболические изменения в отдаленном периоде после инфекции. Одним из таких классов биомаркеров являются микроРНК (miR) — короткие некодирующие РНК длиной около 22 нуклеотидов, участвующие в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. Известно, что циркулирующие микроРНК устойчивы в биологических жидкостях и рассматриваются как перспективные индикаторы воспаления и метаболической дисрегуляции [6, 7].
Для настоящего исследования на основании данных литературы была выбрана панель микроРНК, ассоциированных с метаболическими нарушениями и функцией β-клеток поджелудочной железы. Так, miR-375 относится к наиболее изученным микроРНК, связанным с повреждением островков Лангерганса, нарушением секреции инсулина; miR-122 участвует в регуляции липидного обмена и функции печени; miR-146a рассматривается как регулятор врожденного иммунного ответа; miR-125b, miR-140 и miR-93 могут быть вовлечены в воспалительные, стресс-сигнальные и метаболические пути [8, 9]. Следует отметить, что данные о профиле циркулирующих микроРНК у пациентов в постковидном периоде, особенно при НУО, остаются ограниченными и носят противоречивый характер [10–12].
Цель настоящего исследования: изучить профиль циркулирующих микроРНК, ассоциированных с метаболическими нарушениями и дисфункцией β-клеток поджелудочной железы, у пациентов, ранее перенесших COVID-19.
Материал и методы
Проведено проспективное когортное исследование на базе НИЛ клинической эндокринологии Института эндокринологии и НИЛ новой коронавирусной инфекции и постковидного синдрома Научного центра мирового уровня «Центр персонализированной медицины» ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России (Санкт-Петербург).
Исследование выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования и форма информированного согласия одобрены этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России 30 ноября 2020 г. (выписка № 11-20-02С). Все участники подписали информированное согласие на участие в исследовании.
Исходно была сформирована когорта пациентов, госпитализированных с COVID-19 средней и тяжелой степени тяжести; динамический визит проводился через 6–12 мес. после выписки из стационара. В исследование вошли 64 (45,4%) мужчины и 77 (54,6%) женщин в возрасте от 18 до 75 лет без тяжелой соматической патологии; медиана возраста составила 57 [49; 67] лет, без ранее известных НУО на момент поступления в инфекционный стационар. В рамках динамического обследования проводилось комплексное клинико-лабораторное обследование. Гликемический статус оценивали по уровню глюкозы плазмы натощак и гликированного гемоглобина (HbA1c). Наличие НУО оценивали согласно критериям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ, 1999–2013).
Для оценки функционального состояния β-клеток и чувствительности тканей к инсулину определяли концентрацию инсулина и С-пептида в сыворотке крови на автоматическом анализаторе Cobas Integra e411. Уровень адипонектина в сыворотке крови исследовали набором High Molecular Weight (HMW) and Total Adiponectin ELISA (ALPCO), резистина — набором Human Resistin (RayBiotech), лептина — набором Leptin ELISA Kit (DBC).
Для молекулярно-генетического этапа были сформированы основные группы пациентов (по 36 человек) с НУО (группа 1) и с нормальным гликемическим статусом (группа 2), которые были сопоставимы по основным демографическим, клинико-лабораторным и инструментальным характеристикам, а также по терапии, проводившейся в остром периоде COVID-19. Контрольную группу составили 16 условно здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту, с нормальным гликемическим профилем и без указаний на перенесенную ранее инфекцию COVID-19. Периферическую кровь для исследования микроРНК забирали из локтевой вены в вакутейнеры с К2-ЭДТА; после подготовки плазмы и выделения водной фазы, содержащей РНК, нуклеиновые кислоты осаждали с использованием GlycoBlue Coprecipitant (Thermo Fisher Scientific, США) и изопропанола, после чего осадок РНК отмывали 75% этанолом, ресуспендировали в RNase-free воде и хранили при -80 °C до дальнейшего анализа. Обратную транскрипцию выполняли с использованием TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, США) на термоциклере Applied Biosystems Veriti, а амплификацию и детекцию кДНК проводили методом ПЦР в режиме реального времени с применением TaqMan Universal Master Mix II, no UNG и анализом данных в LightCycler 480 Software version 1.5.1.62 SP3 (Roche, Швейцария). Относительную экспрессию микроРНК рассчитывали методом 2-ΔΔCt с нормализацией по miR-39-3p.
Количественные показатели представлены в виде медианы и межквартильного интервала Me [Q1; Q3]. Для статистического анализа использовали непараметрические критерии (Манна — Уитни, Краскела — Уоллиса), корреляционный анализ Спирмена.
Результаты исследования
В обследованной когорте НУО через 6–12 мес. после перенесенной новой коронавирусной инфекции были выявлены у 47 (33,3%) из 141 пациента. При оценке уровня глюкозы плазмы натощак и HbA1c сахарный диабет 2 типа впервые диагностирован у 9 (6,3%) пациентов: у 7 (4,9%) — на основании сочетания HbA1c >6,5% с повышением гликемии, у 2 (1,4%) — при повторно зарегистрированной гликемии натощак ≥7,0 ммоль/л. Предиабет по критериям ВОЗ выявлен у 38 (26,9%) пациентов (рис. 1).
При сравнительном анализе пациенты с НУО были старше по сравнению с лицами с нормогликемией (60 [52; 65] лет против 56 [47; 65] лет; p=0,024), характеризовались более высоким индексом массы тела (29,8 [26,3; 33,4] кг/м2 против 27,9 [25,7; 31,0] кг/м2; p=0,048), а также большей частотой сердечно-сосудистых заболеваний (78,7% против 48,9%; p<0,001).
Анализ метаболических показателей показал, что у пациентов с НУО значения индекса инсулинорезистентности HOMA-IR были выше, чем у пациентов с нормальным уровнем гликемии (2,98 [2,28; 3,91] против 1,94 [1,42; 2,92]; p=0,001). Одновременно в этой группе отмечались более низкие значения индекса функциональной активности β-клеток HOMA-B (84 [72,7; 121] против 131 [83,3; 196]; p=0,013). При этом не было выявлено статистически значимых различий между пациентами с НУО и лицами с нормогликемией по уровням лептина, адипонектина и резистина (p>0,05).
При оценке панели циркулирующих микроРНК установлено, что у пациентов после перенесенного COVID-19, независимо от гликемического статуса, относительная экспрессия miR-146a, miR-125b и miR-140 была значимо выше, чем в контрольной группе (p<0,05). У пациентов с НУО, выявленными в постковидном периоде, дополнительно регистрировали повышение относительной экспрессии miR-122 и miR-93 по сравнению с контрольной группой (p<0,05). В то же время экспрессия miR-375 значимо не различалась между группами (p>0,05) (рис. 2).
Корреляционный анализ выявил тесные положительные связи внутри исследуемого кластера микроРНК. Так, ассоциации отмечены между miR-140, miR-146a и miR-93; коэффициенты корреляции находились в диапазоне r=0,632-0,801 (p<0,01 для всех сравнений).
Дополнительно корреляции с показателями углеводного обмена были получены для miR-140 и miR-93. Так, показатель экспрессии miR-140 отрицательно коррелировал с уровнем инсулина (r=-0,31; p=0,04), индексом HOMA-IR (r=-0,31; p=0,04) и С-пептидом (r=-0,29; p=0,05). Кроме того, схожие закономерности были выявлены и для miR-93, а именно отрицательные корреляции с инсулином (r=-0,39; p=0,02), HOMA-IR (r=-0,41; p=0,01) и С-пептидом (r=-0,39; p=0,02).
Обсуждение
Полученные в исследовании результаты подтверждают связь между перенесенным COVID-19 средней и тяжелой степени как с метаболическими нарушениями, так и с изменением профиля циркулирующих микроРНК в отдаленном периоде. Выявленные НУО у трети обследованных пациентов через 6–12 мес. после перенесенной инфекции согласуются с современными представлениями о повышенном риске дисгликемии на фоне и после COVID-19, особенно у пациентов, в силу тяжести инфекции нуждавшихся в госпитализации [2–4]. Дополнительно повышение относительной экспрессии miR-146a, miR-125b и miR-140 у пациентов после COVID-19 независимо от гликемического статуса может отражать универсальные для реконвалесцентов молекулярно-генетические изменения после перенесенной инфекции. Так, miR-146a известна как регулятор врожденного иммунного ответа и сигнального пути NF-kB, и повышение ее экспрессии может быть связано с персистирующей иммунной активацией и попыткой ограничения воспалительного ответа. В совокупности с повышением экспрессии miR-125b и miR-140 выявленный профиль изменений может рассматриваться как следствие воспалительных изменений после перенесенного COVID-19 [6, 10–12].
Следует отметить тот факт, что особое значение у пациентов с НУО имеет повышение экспрессии miR-122 и miR-93. Известно, что miR-122 преимущественно ассоциирована с функцией печени, липидным обменом и кардиометаболическими нарушениями, что делает ее потенциально важной для интерпретации дисгликемии в контексте системного метаболического ответа. В то же время увеличение экспрессии miR-93 может отражать вовлечение путей, связанных с инсулиновым сигналингом, энергетическим обменом и воспалительной регуляцией [8, 9].
Кроме того, представляется важным отсутствие статистически значимых различий в экспрессии miR-375. С одной стороны, miR-375 является одной из ключевых микроРНК, связанных с функцией островков Лангерганса и регуляцией секреции инсулина [8]. С другой стороны, в настоящем исследовании ее циркулирующая фракция не различалась между группами, что может быть обусловлено как сроками обследования больных, так и различием между экспрессией тканевой и циркулирующей микроРНК, а также ограниченным числом образцов для молекулярного анализа.
Выявленные изменения профиля циркулирующих микроРНК дополняют представления о многофакторном патогенезе постковидных НУО, ассоциированных с системным воспалением, инсулинорезистентностью, дисфункцией жировой ткани, лекарственно-индуцированным и аутоиммунным механизмом, а также повреждением эндокринного аппарата поджелудочной железы [5, 13–15]. В дальнейшем целесообразны исследования с большим объемом выборки, динамическим определением микроРНК и фенотипированием пациентов по показателям секреции инсулина, инсулинорезистентности и аутоиммунного ответа.
В то же время следует отметить ограничения настоящего исследования, к которым относятся сравнительно небольшой объем выборки для молекулярно-генетического анализа, отсутствие исходного профиля микроРНК до инфицирования COVID-19 и невозможность окончательно разграничить вклад перенесенной инфекции и сопутствующих метаболических факторов риска.
Заключение
У пациентов, перенесших COVID-19 средней и тяжелой степени, в постковидном периоде часто встречаются НУО, а также выявляется изменение профиля циркулирующих микроРНК, ассоциированных с воспалением, стресс-сигналингом и метаболической регуляцией. Повышение экспрессии miR-146a, miR-125b и miR-140, независимо от гликемического статуса, может отражать сохраняющуюся молекулярную активацию после перенесенной инфекции. Дополнительное повышение экспрессии miR-122 и miR-93 у пациентов с НУО, а также их ассоциации с уровнем инсулина, HOMA-IR и С-пептида указывают на потенциальную роль этих микроРНК в формировании предиабета и сахарного диабета, ассоциированных с перенесенным COVID-19. Таким образом, полученные данные позволяют рассматривать циркулирующие микроРНК как перспективное направление для дальнейшего изучения.
Источник финансирования
Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение № 075-15-2022-301 от 20.04.2022).
