Оптимизация диагностики герпес-вирусной инфекции 8 типа

Импакт фактор - 0,750*

*Импакт фактор за 2017 г. по данным РИНЦ

Журнал входит в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК.

Ключевые слова
Похожие статьи в журнале РМЖ

Читайте в новом номере

Регулярные выпуски «РМЖ» №1(II) от 30.04.2019 стр. 62-65
Рубрика: Инфекция
Цель исследования: изучение взаимосвязи иммунологических показателей с маркерами вируса герпеса человека 8 типа (ВГ-8) для выявления лабораторных вариантов состояния вирусной репродукции и иммунитета человека у пациентов с саркомой Капоши (СК) и выделения прогностических маркеров обострения заболевания.
Материал и методы: проведено комплексное обследование 22 пациентов с СК. Применялся метод иммуноферментного анализа для определения иммуноглобулинов класса G (IgG) к малому капсидному протеину (МКП) ВГ-8, метод полимеразной цепной реакции для определения ДНК ВГ-8 в мононуклеарах периферической крови человека (МПК) и в биоптате из очага СК. Оценивалась продукция интерферона α (ИФН-α), интерлейкинов: ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, рецепторного антагониста к ИЛ-1 (РА-ИЛ-1).
Результаты исследования: обнаружена корреляция между IgG к МКП ВГ-8 и пониженными значениями ИФН-α, а также между выявлением ДНК ВГ-8 и повышенным количеством РА-ИЛ-1. Самое высокое содержание ИФН-α у пациентов с СК отмечается при отсутствии антител к ВГ-8. Медиана количества РА-ИЛ-1 у пациентов с выявленной ДНК ВГ-8 составила 838 пг/мл, а у пациентов с невыявленной ДНК — 187,5 пг/мл (р=0,0015). Показано повышение уровня провоспалительного ИЛ-1β в сыворотке крови пациентов с наличием IgG к ВГ-8 (р=0,0016). Показано, что при обнаружении ДНК ВГ-8 в МПК выявляются более высокие значения ИЛ-6 и наименьшие значения ИЛ-8 в сыворотке крови пациентов с СК.
Заключение: выявлены прогностические маркеры обострения герпес-вирусной инфекции 8 типа и выделены 4 лабораторных варианта СК, что позволит повысить эффективность диагностики и проводить комплекс профилактических мер по предотвращению прогрессирования СК.

Ключевые слова: вирус герпеса человека 8 типа, саркома Капоши, иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция, иммуноглобулины класса G, интерферон α, интерлейкин, рецепторный антагонист к ИЛ-1.

Для цитирования: Н.Д. Львов, Е.М. Панюкова, М.В. Мезенцева Оптимизация диагностики герпес-вирусной инфекции 8 типа // РМЖ. 2019. №1(II). С. 62-65
Diagnosis optimization for the human herpesvirus type 8

N.D. Lvov, E.M. Panyukova, M.V. Mezentseva

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after N.F. Gamaleya, Moscow

Aim: to study an association of immunological parameters with human herpesvirus type 8 (HHV-8) markers for the laboratory variants determination of viral reproduction and human immunity condition in patients with Kaposi’s sarcoma (KS) and prognostic markers selection of the disease exacerbation.
Patients and Methods: 22 patients with KS underwent a comprehensive study. The following methods were applied in this study: ELISA for the HHV-8 small capsid protein (SCP) IgG determination in human serum and polymerase chain reaction for the HHV-8 DNA determination in human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and in a biopsy sample from the KS focus. The production of interferon α (IFN-α), interleukins IL-1β, IL-6, IL-8, IL-1 receptor antagonist (IL-1 RA).
Results: a correlation between the HHV-8 SCP IgG detection and reduced IFN-α values, as well as between the HHV-8 DNA detection and increased IL-1 RA values, were found. The highest IFN-α levels in patients with KS were observed in the absence of HHV-8 antibodies. The IL-1 RA median value in patients with detected HHV-8 DNA was 838 pg/ml, and in patients without detected DNA — 187.5 pg/ml (p=0.0015). The proinflammatory IL-1β level increase in the patients’ serum with the HHV-8 IgG presence (p=0.0016) was shown. It was also shown that the HHV-8 DNA detection in the PBMC revealed higher IL-6 values and lower IL-8 values in patients’ serum with KS.
Conclusion: prognostic markers determination of the HHV-8 exacerbation and 4 KS laboratory variants selection were conducted, which can improve the HHV-8 diagnosis effectiveness to carry out a set of prophylactic measures for KS progression prevention.

Keywords: human herpesvirus type 8, Kaposi’s sarcoma, enzyme immunoassay, polymerase chain reaction, immunoglobulin G, interferon α, interleukin, IL-1 receptor antagonist.
For citation: Lvov N.D., Panyukova E.M., Mezentseva M.V. Diagnosis optimization for the human herpesvirus type 8. RMJ. 2019;1(II):62–65.

В статье представлены результаты оригинального исследования, посвященного изучению взаимосвязи иммунологических показателей с маркерами вируса герпеса человека 8 типа для выявления лабораторных вариантов состояния вирусной репродукции и иммунитета человека у пациентов с саркомой Капоши и выделения прогностических маркеров обострения заболевания.


   Введение

    Вирус герпеса 8 типа (ВГ-8) — этиологический агент ряда заболеваний, в число которых входит саркома Капоши 
(СК) [1–4]. Наиболее часто СК встречается в странах Африки, южнее Сахары, где герпес-вирусная инфекция 8 типа (ГВИ-8) является эндемичной и распространена более чем у 90% населения. У детей восточной и центральной Африки частота встречаемости ГВИ-8 — 25–60% [5].
    Геном ВГ-8 обнаруживается во всех элементах СК при всех стадиях заболевания независимо от клинического варианта [4]. Чаще всего постановка диагноза СК, подтвержденного гистологическими исследованиями биоптата, не вызывает затруднений. Однако в ряде случаев, например на ранних этапах формирования СК, когда гистологическая картина нечеткая, и при иных сосудистых опухолях, этиологически не связанных с ВГ-8, но симулирующих очаги СК, бывает необходимо применение дополнительных диагностических процедур, позволяющих провести дифференциальный диагноз.
    С этой целью зарубежные исследователи проводят диагностику маркеров ВГ-8 в крови пациента и в очаге СК. Применяются различные методы диагностики: иммуноферментный анализ (ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР), гнездовая ПЦР (Нестед-ПЦР), гибридизация in situ, иммуногистохимический анализ [1, 6, 7].
    Применение только ИФА недостаточно для высокоэффективной диагностики маркеров ВГ-8, поэтому часто сочетают применение разных тест-систем к различным вирусным белкам, а также применяют дополнительно другие методы. Неудовлетворительная чувствительность ИФА может объясняться, например, недостаточной иммуногенностью различных вирусных белков у части обследуемых или отсутствием литической активации, когда в тест-системе выявляются белки капсида или вирусной оболочки. При применении рекомбинантных белков в наборах ИФА необходимо помнить, что рекомбинантный белок не является точной копией нативного белка и часто представляет собой его усеченный вариант.
    Применение ПЦР тоже не всегда эффективно. При латентной ГВИ-8 концентрация вирусной ДНК в крови пациента невелика и может не определяться из-за недостаточной чувствительности тест-системы. Следовательно, метод ПЦР также не является вполне надежным для диагностики инфекции, вызванной ВГ-8.
    Мы предлагаем использовать комплексную диагоностику: ИФА для определения иммуноглобулинов класса G (IgG) к малому капсидному протеину ВГ-8 в сыворотке крови человека, ПЦР для определения ДНК ВГ-8 в мононуклеарах периферической крови человека (МПК) и в биоптате из очага СК, а также определение продукции интерферона α (ИФН-α), интерлейкина 1β (ИЛ-1β), рецепторного антагониста к ИЛ-1 (РА-ИЛ-1), ИЛ-6 и ИЛ-8 [1, 8]. Это позволяет повышать диагностическую эффективность исследования и выявлять активацию литического цикла вируса. Выявление прогностических факторов усиления вирусной инфекции позволит реагировать на возможные обострения комплексом профилактических мер, своевременно корректируя нарушения в иммунной системе.

   Материал и методы

    В комплексном исследовании участвовали 22 пациента с СК. Проведение ПЦР и ИФА соответствовало производственным протоколам выполнения процедур.
    Техника постановки тестов ПЦР. Гепаринизированную кровь наслаивают на 2,0 мл раствора фиколла в центрифужной пробирке, затем центрифугируют при 2000 об./мин 30 мин. Отбирают взвесь мононуклеаров в отдельную пробирку, отмывают дважды 0,9% NaCl. Затем в МПК добавляют 200 мкл лизирующего буфера с протеиназой К, ставят в твердотельный термостат на 55 °С на 1 ч, каждые 15 мин встряхивая на вортексе. Затем пробу выдерживают 15 мин при 90 °С.
    Аналогично размельченный в ступке биоптат помещают в пробирку, добавляют 200 мкл лизирующего буфера с протеиназой К, ставят в твердотельный термостат на 55 °С на 2 ч, каждые 15 мин встряхивая на вортексе. Затем пробу выдерживают 15 мин при 90 °С. Приготовленные образцы хранят при температуре -20 °С.
    Вирусную ДНК определяют с помощью наборов ПЦР согласно протоколу производителя. Амплификацию осуществляют на аппарате «Терцик». Электрофорез к ДНК проводится в 1% агарозном геле с бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в трис-ацетатном буфере, содержащем 0,2 мкл ЭДТА. Электрофорез проводится в горизонтальных камерах Bio-Rad (США) 35 мин.
    Фотографируют результаты на цифровую камеру Gel Imager-2 (Россия) под мягким ультрафиолетовым освещением 360 нм.
    Техника постановки тестов ИФА. Для определения IgG к малому капсидному протеину ВГ-8, ИФН-α и РА-ИЛ-1 применяют специальные тест-системы (Россия). В качестве аналита используют сыворотку крови пациентов. Процедуру проводят согласно протоколу фирмы-производителя. Для считывания используют планшетный ридер «Пикон» (Россия).
    Статистическая обработка результатов исследования проводилась в программах Statistica 6 и Statistica 9.

   Результаты и обсуждение

   
Обнаружение маркеров ВГ-8 хотя бы одним из описанных методов облегчает постановку дифференциального диагноза в случае сомнительной гистологической картины исследуемой гемангиомы. В частности, использование одного метода ИФА, либо одного метода ПЦР с определением ДНК в МПК позволяет определять антитела к малому капсидному протеину ВГ-8 в 45% случаев. Сочетанное использование этих двух методов выявляет маркеры ВГ-8 в 77% случаев, а определение при этом ДНК ВГ-8 в биоптате из очага СК повышает диагностическую чувствительность до 100% [1].
    Анализ взаимосвязи ряда иммунологических показателей с маркерами ВГ-8 обнаружил корреляцию между выявлением антител IgG к МКП ВГ-8 и пониженным содержанием ИФН-α, а также между выявлением ДНК ВГ-8 и повышенным содержанием РА-ИЛ-1.
    Определение содержания ИФН-α у пациентов с СК позволяет оценивать риски возможной литической активации ВГ-8, т. к. уровень ИФН-α в сыворотке крови коррелирует с антителами к малому капсидному протеину ВГ-8, а самое высокое содержание ИФН-α у пациентов с СК отмечается при отсутствии антител к ВГ-8. Это дает возможность своевременно проводить профилактический курс лечения, предотвращать появление новых очагов СК, останавливать рост уже имеющихся очагов и улучшать общее состояние пациента.
    Зависимость распределения значений ИФН-α, определяемых в сыворотке крови больных СК, от выявления IgG к ВГ-8 графически представлена на рисунке 1.
Медиана в подгруппе пациентов без IgG составила 0,0 пг/мл, в подгруппе пациентов с СК с выявленными антителами к ВГ-8 — 12,38 пг/мл (р=0,01).
Рис. 1. Распределение значений ИФН-a по признаку выявления антител класса IgG к ВГ-8 в двух подгруппах пациентов с СК
    Для выяснения степени падения иммунитета в момент литической активации мы разбили группу СК (n=22) на подгруппы в зависимости от титра антител IgG к МКП ВГ-8. На основании величины оптической плотности мы выделили подгруппы: «-», где антитела не выявлялись, «±» — где оптическая плотность не превышала 0,5, «+» — с оптической плотностью 0,5–1,0, «++» — с оптической плотностью 1,0–2,0, «+++» — с оптической плотностью 2,0–3,0 и «++++» — с оптической плотностью >3,0 (рис. 2). В подгруппу «±» вошел только 1 больной. В подгруппах «++» и «+++» не оказалось ни одного больного. В итоге мы получили 2 подгруппы: 1-я подгруппа (-) — пациенты с отсутствием антител класса IgG к МКП ВГ-8 и 2-я подгруппа (+) — пациенты с наличием антител класса IgG к МКП ВГ-8. На основании анализа данных мы получили статистически достоверное отличие между этими двумя подгруппами (р=0,02).
Рис. 2. Распределение значений ИФН-a в зависимости от титра антител класса IgG к ВГ-8
    Как видно из данных, представленных на рисунках 1 и 2, наибольшие значения ИФН-α наблюдаются в сыворотке пациентов без антител IgG к ВГ-8. Однако при наличии антител по мере роста оптической плотности наблюдается увеличение значений ИФН-α. Несомненно, процесс подавления репликации вируса сопровождается усилением барьера для вирусной инфекции, увеличением выработки ИФН-α, что полностью укладывается в полученную нами картину распределения.
    Другой закономерностью, выявленной в результате статистического анализа, оказалось повышение уровня 
РА-ИЛ-1 у больных СК с выявленной ДНК ВГ-8, результат представлен на рис. 3.
    Медиана в подгруппе с выявленной ДНК ВГ-8 составила 838 пг/мл, а в подгруппе с невыявленной ДНК — 187,5 пг/мл (р=0,0015).
Рис. 3. Распределение значений рецепторного антагониста к ИЛ-1 по признаку выявления ДНК ВГ-8 у пациентов с СК
    Повышенное содержание РА-ИЛ-1 и снижение уровня самого ИЛ-1 уточняет момент снижения воспалительной активности через некоторое время после активации инфекции. Наши исследования показали, что уровень РА-ИЛ-1 повышен в случае выявления ДНК в МПК пациентов с СК (см. рис. 3), содержание ИЛ-1, напротив, снижено. Усиление синтеза РА-ИЛ-1 можно рассматривать как реакцию на поглощение макрофагами вирусной ДНК либо как компенсаторную реакцию иммунитета, ограничивающую эскалацию воспалительных процессов, поскольку для группы СК показано повышение уровня провоспалительного ИЛ-1β в сыворотке крови (р=0,0016) (рис. 4). Анализ содержания ИЛ-1 и РА-ИЛ-1 в сыворотке крови помогает контролировать активность воспалительного процесса с тем, чтобы корректировать терапию.
Рис. 4. Распределение количества ИЛ-1b, определяемого методом ИФА, у пациентов с СК в зависимости от выявления антител класса IgG к малому капсидному протеину ВГ-8
    Определение содержания ИЛ-6 (рис. 5) показано у пациентов с СК для установления активности воспаления и давности активации вирусной инфекции, вызванной ВГ-8. Для ИЛ-6 физиологическим стимулятором является ИЛ-1, и повышение уровня ИЛ-6 происходит после выработки ИЛ-1. Поэтому уровень ИЛ-6 зависит от степени воспалительной активности и уровня ИЛ-1. ИФН-α также способен стимулировать выработку ИЛ-6. Показано, что при обнаружении ДНК ВГ-8 в МПК выявляются более высокие значения ИЛ-6 в сыворотке крови — это означает, что усиление вирусной репликации до величин, доступных для детекции методом ПЦР, по времени совпадает с повышением уровня ИЛ-6.
Рис. 5. Распределение количества ИЛ-6, определяемого методом ИФА, у пациентов с СК в зависимости от выявления ДНК ВГ-8 в моноцитах периферической крови методом ПЦР
    В проведенных нами исследованиях наименьшие значения ИЛ-8 в сыворотке крови отмечались в случае обнаружения у пациентов с СК антител к МКП ВГ-8 (рис. 6), т. е. падение выработки ИЛ-8 по времени совпадает с активацией литического цикла ВГ-8. Содержание ИЛ-8, который является хемоаттрактантом, в сыворотке крови пациентов с СК косвенно указывает на миграцию различных иммунных клеток в очаг воспаления, что дает потенциальную возможность своевременно купировать активацию инфекции, вызванной ВГ-8.
Рис. 6. Распределение уровня ИЛ-8, определяемого методом ИФА, у пациентов с СК в зависимости от обнаружения IgG к ВГ-8
    Обобщенные данные об ассоциации цитокинов с уровнем маркеров ГВИ-8 представлены в таблице 1.
Таблица 1. Ассоциация маркеров ГВИ-8 с уровнем цитокинов у больных СК
    Анализ полученных результатов исследования позволяет выделить 4 лабораторных варианта течения СК по состоянию вирусной репродукции и иммунитета человека (табл. 2).
Таблица 2. Сочетания вирусных и иммунных маркеров у больных СК
    Вариант I: отсутствие маркеров ВГ-8 совместно с высоким уровнем ИФН-α и сниженным количеством РА-ИЛ-1 говорит об отсутствии обострения.
    Вариант II: наличие IgG к ВГ-8 и отсутствие ДНК ВГ-8 в крови, а также снижение ИФН-α и повышенные уровни РА-ИЛ-1 в сыворотке крови больных СК. Это закономерно при начинающемся процессе литической активации размножения вируса на фоне снижения клеточного иммунитета, причем о давности активации можно судить по нарастанию титра антител IgG к ВГ-8.
    Вариант III: наличие ДНК ВГ-8 в МПК, выявление IgG к ВГ-8 и высоких уровней РА-ИЛ-1 в сыворотке крови больных СК. Вероятно, этот вариант характеризует ограничение воспалительных реакций.
    Вариант IV: стадия ремиссии на фоне возросшего антивирусного иммунитета, определяемого по повышенным значениям ИФН-α и умеренным уровням РА-ИЛ-1.

   Заключение

    Таким образом, для комплексной диагностики ГВИ-8 и перспектив нейтрализации ее активности у пациентов с СК в период роста опухоли и отсева новых очагов, а также при ухудшении общего состояния пациента показано определять содержание в сыворотке крови ИФН-α, ИЛ-1, РА-ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-8. Совокупность этих параметров в комплексе с маркерами ВГ-8 позволит также оценить, на каком этапе находится активация инфекции, вызванной ВГ-8.
    Сочетанное использование методов ИФА и ПЦР с определением ДНК в МПК позволяет повысить диагностическую чувствительность выявления ГВИ-8 у пациентов с СК. Исследование содержания ИФН-α у пациентов с СК позволяет оценивать риски возможной литической активации ВГ-8. Анализ содержания ИЛ-1 и РА-ИЛ-1 в сыворотке крови помогает осуществлять мониторинг активности воспалительного процесса с тем, чтобы корректировать терапию. Определение содержания ИЛ-6 показано у пациентов с СК для оценки активации вирусной инфекции, вызванной ВГ-8, т. к. усиление вирусной репликации до величин, доступных для детекции методом ПЦР, по времени совпадает с повышением уровня ИЛ-6. Мониторинг ИЛ-8 показано проводить для оценки потенциальной возможности и сроков достижения ремиссии при СК.
    Таким образом, начало литической активации ВГ-8, сопровождаемой ростом титра антител к МКП ВГ-8, постепенным увеличением уровня ИФН-α, высоким содержанием ИЛ-1 и невысоким уровнем ИЛ-6, постепенно сменяется ситуацией, когда на фоне повышенной частоты обнаружения ДНК ВГ-8 отмечаются повышенные уровни ИЛ-6, рецепторного антагониста к ИЛ-1 и падение уровня самого ИЛ-1.
    Комплексная диагностика дает возможность проводить своевременный профилактический курс лечения, предотвращать появление новых очагов СК, останавливать рост уже имеющихся очагов и улучшать общее состояние пациента.
Литература
1. Потапова Л.А., Косякова Н.П., Махнева Н.В., Мезенцева М.В. Вирус герпеса 8-го типа и его роль в патологии человека. Вопросы вирусологии. 2009.6:18–24. [Potapova L.A., Kosyakova N.P., Makhneva N.V., Mezentseva M.V. Herpes virus type 8 and its role in human pathology. Questions of virology. 2009.6:18–24 (in Russ.)].
2. Сesarman E., Damania B., Krown S.E. et al. Kaposi sarcoma. Review. Nat Rev Dis Primers. 2019:5(1):9.
3. Oksenhendler E., Boutboull D., Galicier L. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus/human herpesvirus 8 — associated lymphoproliferative disorders. Review. Blood. 2019;133(11):1186–1190.
4. Regnier-Rosencher E., Guillot B., Dupin N. Treatments for classic Kaposi sarcoma: A systematic review. J. Am Acad Dermatol. 2013;68(2):313–331.
5. Anglemyer A., Agrawal A.K., Rutherford G.W. Treatment of Kaposi sarcoma in children with HIV-1 infection. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014;1:CD009826.
6. Marashi S.M., Mostafa A., Shoja Z. et al. Human herpesvirus 8 DNA detection and variant analysis in patients with multiple sclerosis. Virus Disease. 2018;29(4):540–543.
7. Bassey B., Asuguo M., Akanmu A. Epstein-Barr Virus, Human Herpesvirus 8, and Human T-Lymphotropic Virus Type 1 Infections Amongst Patients With Lymphoid Malignancies:Exploring Causal Relationship, in Calabar. Am. J. Clin. Pathol. 2018;150:S93–S115.
8. Mui U.N., Haley C.T., Vangipuram R., Tyring S.K. Human Oncoviruses: Mucocutaneous Manifestations, Pathogenesis, Therapeutics, and Prevention (Part II: Hepatitis Viruses, Human T-cell Leukemia Viruses, Herpesviruses, and Epstein-Barr Virus). J Am Acad Dermatol. 2018;S0190–9622(18):32964–32965. DOI: 10.1016/j.jaad.2018.10.072.

Только для зарегистрированных пользователей

зарегистрироваться

Поделитесь статьей в социальных сетях

Порекомендуйте статью вашим коллегам

Предыдущая статья
Следующая статья

Авторизируйтесь или зарегистрируйтесь на сайте для того чтобы оставить комментарий.

зарегистрироваться авторизоваться
Наши партнеры
Boehringer
Jonson&Jonson
Verteks
Valeant
Teva
Takeda
Soteks
Shtada
Servier
Sanofi
Sandoz
Pharmstandart
Pfizer
 OTC Pharm
Lilly
KRKA
Ipsen
Gerofarm
Farmak
Egis
Зарегистрируйтесь сейчас и получите доступ к полезным сервисам:
  • Загрузка полнотекстовых версий журналов (PDF)
  • Актуальные новости медицины
  • Список избранных статей по Вашей специальности
  • Анонсы конференций и многое другое

С нами уже 50 000 врачей из различных областей.
Присоединяйтесь!
Если Вы врач, ответьте на вопрос:
Дисфагия это:
Нажимая зарегистрироваться я даю согласие на обработку моих персональных данных
Зарегистрироваться
Если Вы уже зарегистрированы на сайте, введите свои данные:
Войти
Забыли пароль?
Забыли пароль?