Считается, что клинический эффект ГА во многом обусловлен подавлением иммунного ответа неродственным антигеном. Он был разработан как имитатор аутоантигена основного белка миелина (ОБМ), который атакует иммунную систему при РС. После гидролитического разрушения в месте инъекции ГА предположительно связывается с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса II на антиген-представляющих клетках (АПК), что инициирует выработку ГА-специфичных Т-клеток, преимущественно Т-хелперов 2-го типа (Th2) [2]. Кроме того, ГА стимулирует дифференцировку моноцитов 2-го типа непосредственно в Th2-лимфоциты и защитные регуляторные Т-клетки (Treg) [3, 4]. ГА-специфичные Т-клетки мигрируют через гематоэнцефалический барьер, вступая в перекрестную реакцию с ОБМ, имеющим сходную химическую структуру. Данная реакция стимулирует местную секрецию противовоспалительных цитокинов, смещая баланс популяции этих клеток с провоспалительного фенотипа (Th1/Th17) к противовоспалительному фенотипу (Th2/Treg) [2]. Кроме того, ГА способствует выработке нейротрофических факторов, таких как нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), и стимулирует активацию В-лимфоцитов, что представляется необходимым для ответа ГА на экспериментальных моделях РС на животных [5]. ГА также может оказывать действие и через ряд дополнительных механизмов.
АПК занимают центральное место в механизме действия ГА, поскольку их присутствие необходимо для запуска представления препарата в Т-клетках на периферии и для взаимодействия ГА-специфичных Т-клеток с аутоантигенами в мозге. Кроме того, ГА стимулирует сдвиг фенотипа моноцитов 2-го типа в направлении противовоспалительного фенотипа, что характеризуется увеличением выработки этими клетками противовоспалительных цитокинов (например, интерлейкина (IL) -10) и уменьшением образования в них провоспалительных цитокинов (например, IL-12) [3]. Установлено, что ГА снижает также и экспрессию воспалительного IL-1β и увеличивает экспрессию противовоспалительного sIL-1Ra в моноцитах [6]. Связывание ГА с молекулами ГКГ класса II на АПК необходимо для реализации его действия [2], а аллели в молекулах ГКГ класса II, особенно HLA-DRB*1501, связаны с проявлением терапевтического эффекта препарата [7]. Таким образом, влияние ГА на моноциты человека, скорее всего, является центральным звеном в механизме действия, а значительные различия, наблюдаемые в ответе моноцитов на оригинальный ГА, в сравнении с глатирамоидами других производителей могут быть клинически значимыми. Поэтому нами выбрана хорошо охарактеризованная линия моноцитов человека – ТНР-1 в данной модели системы для контроля за эффектами, наблюдаемыми при введении в систему ГА. Затем результаты были протестированы на первичных моноцитах человека, полученных у здоровых доноров.
Оценка препаратов, разработанных в качестве дженериков ГА, является сложной задачей в связи с низкой чувствительностью стандартных физико-химических и биохимических тестов и отсутствием валидированных фармакокинетических и фармакодинамических биомаркеров действия препарата. Однако некоторые физико-химические исследования выявили различия между оригинальным ГА и другими глатирамоидами [1]. В ходе сложных физико-химических исследований заявленные как дженерики ГА вещества, протестированные к настоящему времени, продемонстрировали определенные сходные с ГА характеристики. В то же время были обнаружены различия, указывающие на то, что для определения возможной идентичности ГА и дженерика может потребоваться проведение дополнительных, не связанных между собой тестов. Действительно, разработка методов оценки идентичности веществ из группы NBCD остается открытым вопросом в науке.
Одним из глатирамоидов, продемонстрировавших наличие возможных отличий от ГА, является Пробиоглат (Пробиомед), заявленный как дженерик ГА, получивший разрешение на медицинское применение в Мексике с января 2013 г. Число нежелательных явлений и рецидивов, зарегистрированных в рамках программы поддержки пациентов компанией «Тева» в Мексике, значительно увеличилось в 2013 г., когда пациентам выписывали ГА или Пробиоглат, в сравнении с 2012 г., когда все пациенты в базе данных принимали только оригинальный ГА. Для сравнения ГА с Пробиоглатом и дальнейшего изучения механизма действия ГА мы изучили профили экспрессии генов для каждого из препаратов на клетках линии моноцитов человека (линия ТНР-1) при помощи микроматричного анализа на уровне всего генома с использованием свыше 47 тыс. наборов зондов.
Результаты
Механизм действия ГА. Чтобы понять механизм действия ГА, было исследовано влияние ГА на моноциты человека линии ТНР-1, поскольку, как уже было сказано, АПК в целом, включая и моноциты в частности, участвуют в реализации терапевтического эффекта ГА [3, 4, 6, 8, 9]. В клеточной линии ТНР-1 была использована для оценки эффектов ГА [10]. Кроме того, ранее было установлено, что гены моноцитов демонстрировали иную экспрессию под влиянием еще одного заявленного в качестве дженерика ГА производства компании «Натко» (Индия), по сравнению с Копаксоном [11].
Было проведено сравнение уровней экспрессии матричной РНК (мРНК) под действием ГА и контрольного препарата маннитола с использованием 6 повторных образцов для каждой из 4 партий ГА и для маннитола с применением метода LIMMA [12]. Наблюдалась значительная модуляция экспрессии многих генов (значение р с коррекцией по уровню ложноположительных результатов (ЛПР) <0,05) в каждой временной точке при приеме оригинального ГА (табл. 1). Например, через 6 ч после введения ГА наблюдались значительное увеличение экспрессии 2824 генов (upregulation) при значении р с коррекцией ЛПР <0,05 (3511 генов с номинальным значением р<0,05) и значительное снижение экспрессии 4066 генов (downregulation) при значении р с коррекцией ЛПР <0,05 (4909 генов с номинальным значением р<0,05). По мере увеличения временного периода с момента введения препарата снижалось число генов со значительной модуляцией, через 12 ч число генов с модуляцией уменьшилось приблизительно вдвое, а через 24 ч – приблизительно в 4 раза (табл. 1). Мы выбрали временную точку 6 ч для первичного анализа последовательности, поскольку данная временная точка отражает максимальное воздействие препарата. Тот факт, что уровень ГА сохраняется в среде для культуры клеток в течение 24 ч, указывает на то, что данное наблюдение, скорее всего, связано не со снижением концентрации препарата, а с тем, что влияние ГА на экспрессию наиболее выражено через 6 ч. Использование данной ранней временной точки также биологически оправданно, поскольку считается, что ГА быстро распадается в месте инъекции и его уровень в крови невозможно измерить [13, 14].
К генам с различным уровнем экспрессии относится ряд противовоспалительных генов. К примеру, через 6 ч увеличивалась экспрессия IL-10, гена, кодирующего образование противовоспалительного цитокина IL-10 (значение р с коррекцией ЛПР 3,1е-9; кратность изменений (КИ) 1,52; рис. 1а). Экспрессия IL-1RN, кодирующего IL-1Ra, который ингибирует действие провоспалительных цитокинов IL-1α и IL-1β, была повышена в каждой из 3-х временных точек. На рисунке 1b представлена временная точка 6 ч для всех имеющихся наборов зондов (значения р с коррекцией ЛПР 6,7е-16, 1,7е-10 и 1,2е-9, КИ 1,43, 1,35 и 1,26 соответственно).
Чтобы определить наличие координированной взаимосвязи генов с различной экспрессией, проведено исследование максимальной либо минимальной экспрессии в ответ на введение тестируемых веществ при помощи метода DAVID [15], как описано в разделе «Методы» (рис. 2а). Показано, что имеет место значительное увеличение числа генов, максимально экспрессирующих под действием ГА в клеточной линии ТНР-1 человека через 6 ч после введения препарата (значение р с коррекцией Бенджамини <0,05), в т. ч. участвующих в функционировании 114 биологических путей, включая множество путей, связанных с иммунитетом. Например, максимально экспрессирующие гены путей взаимодействия «цитокин – цитокин» (hsa04060) представлены на рисунке 2b. Кроме того, под влиянием ГА наблюдалось значительное снижение экспрессии генов 9 путей.
Различия в экспрессии генов при применении Пробиоглата и ГА. Был проведен дифференциальный анализ экспрессии генов для непосредственного сравнения профилей воздействия ГА и заявленного дженерика – глатирамоида Пробиоглата. Для измерения наборов зондов с различной экспрессией во всей микроматрице использовали стандартный набор биопроводников R LIMMA. Были обнаружены многочисленные значимые различия между ГА и Пробиоглатом (табл. 2). Как и ожидалось, на основании более значимого ответа на ГА через 6 ч большинство различий наблюдалось во временной точке 6 ч.
Эти различия относятся к генам с повышением экспрессии под действием Пробиоглата в сравнении с ГА, включая гены CCL5, CCL2, MMP9, MMP1, CXCL10, CD14, ICAM1 и BIRC3 (для всех значение р с коррекцией ЛПР <0,05; описано в разделе «Обсуждение»). Также наблюдались различия в уровне противовоспалительных генов. Пробиоглат понижал регуляцию генов CISH и HSPD1 и повышал регуляцию генов IL-10 и PRDM1 в сравнении с ГА (для всех значение р с коррекцией ЛПР <0,05; описано в разделе «Обсуждение»).
Всего значительное обогащение экспрессии генов наблюдалось в 106 сигнальных путях биологических реакций (значение р с коррекцией по Бенджамини <0,05) среди генов с повышением экспрессии под действием Пробиоглата в сравнении с ГА, включая общие пути, в т. ч. пути процессов в иммунной системе (GO:0002376) и иммунного ответа (GO:0006955), а также многих других путей, связанных с иммунитетом, включая лимфоцит-опосредованный иммунитет (GO:0002706, значение р с коррекцией Бенджамини <0,07) и пролиферацию В-клеток (GO:0042100, значение р с коррекцией Бенджамини <0,049) (рис. 3а). Многие значительно обогащенные пути были связаны с воспалением, включая ответ на липополисахарид (ЛПС) (GO:0032496; рис. 3b), регуляцию воспалительного ответа (GO:0050727), регуляцию выработки фактора некроза опухоли (TNF) (GO:0032680) и сигналы NOD-подобного рецептора (hsa04621) (значение р с коррекцией Бенджамини 8,7е-4, 0,015, 0,028 и 0,027 соответственно). Значительного обогащения путей генов с пониженной экспрессией генов при сравнении Пробиоглата с ГА не наблюдалось.
Метод количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) подтверждает повышение экспрессии провоспалительных маркеров под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч. Для проверки результатов сравнения экспрессии под действием Пробиоглата и ГА для ключевых провоспалительных генов и генов, связанных с РС, проведено независимое исследование 2-х хемокинов (CXCL10, значение р с коррекцией ЛПР <0,0006, КИ 1,46 и CCL5, значение р с коррекцией ЛПР <0,02, КИ 1,09), 2-х матричных металлопротеиназ (ММР) (ММР1, значение р с коррекцией ЛПР <0,002, КИ 1,50 и ММР9, значение р с коррекцией ЛПР <2,8е-6, КИ 1,29), гена маркера поверхности несекретируемых клеток (CD9, значение р с коррекцией ЛПР <0,002, КИ 1,15), который является компонентом миелина, и маркера миелиногенных клеток-предшественников [16] при помощи глубокого анализа количественной ПЦР (кПЦР) (см. «Методы»). Наблюдались значимые различия в экспрессии всех протестированных генов между Пробиоглатом и ГА, как и ожидалось на основании микроматричного анализа (табл. 3).
Уровень белка через 24 ч соответствует повышенной регуляции провоспалительных маркеров мРНК под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч. В том же эксперименте измеряли концентрации белков через 24 ч для проверки повышенной регуляции провоспалительных маркеров под действием Пробиоглата в сравнении с ГА. Принимая во внимание тот факт, что наблюдаемые различия в уровне мРНК не обязательно означают различия в концентрации белка и могут отражать процессы регуляции, использовали набор Luminex для измерения концентрации в панели из 45 хемокинов и цитокинов (в пг/мл). Использовали наборы Bio-Plex Human Chemokine (Bio Rad) и Luminex Performance Assay (R&D). Концентрации белков измеряли в одной реплике через 24 ч, в расчетной временной точке, соответствующей времени трансляции сигналов мРНК, наблюдаемых через 6 ч, в белок. Из 5 генов, протестированных при помощи кОТ–ПЦР, 3 были представлены на панели Luminex: CCL5, CXCL10 и MMP9. Для всех 3-х генов наблюдалась более высокая концентрация соответствующих белковых продуктов в образцах с Пробиоглатом по сравнению с образцами с ГА (КИ 1,5, 2,3 и 1,4 соответственно), что соответствует направленности данных по экспрессии генов (рис. 4 а–с). Два других вышеупомянутых гена – IL-10 и CCL2 были также представлены на панели Luminex и показали более высокий уровень концентрации белка под влиянием Пробиоглата по сравнению с ГА (КИ 1,8 и 1,3 соответственно), что соответствует направленности, наблюдаемой для уровня мРНК (рис. 4 d, e).
Проведена оценка повышения экспрессии ключевых генов под действием Пробиоглата по сравнению с ГА в первичных моноцитах человека. Иммортализованные клеточные линии широко используются в биологических исследованиях и имеют ряд преимуществ, включая единообразие и доступность их получения, однако важно подтвердить, что изменения, вызванные процессом иммортализации, не влияют на ключевые результаты. В этой связи при помощи чувствительного метода кОТ-ПЦР основные результаты данных по экспрессии генов были затем проверены на первичных моноцитах человека, полученных от здоровых доноров. Для тестирования было выбрано 9 генов (CCL2, CCL5, CXCL10, MMP1, MMP9, CD9, ICAM1, IL-10, IL-1RN) на основании представленных выше результатов, полученных на клетках линии моноцитов ТНР-1. В первичных моноцитах, полученных от здорового донора, с 6 репликами большинство протестированных генов показало ожидаемую направленность различий экспрессии между Пробиоглатом и ГА. Пять из этих 9 генов показали статистически значимые различия (рис. 5). К ним принадлежали IL-1RN и провоспалительные CCL2, CCL5, CXCL10 и MMP9 (значения p <0,01 и 0,009, 0,029, 0,02 и 0,009 соответственно).
Обсуждение
Значительные изменения в экспрессии генов, наблюдаемые в клеточной линии моноцитов человека ТНР-1 после введения в культуру клеток оригинального ГА, включают изменения, соответствующие имеющимся литературным источникам (как указано ниже), что подтверждает адекватный выбор модельной системы и дизайна исследования для обнаружения соответствующего терапевтического эффекта.
Например, экспрессия противовоспалительного гена IL-10 увеличивалась во временной точке 6 ч, что соответствует известному механизму действия ГА в моноцитах [3, 4, 17]. Как было указано выше, противовоспалительный эффект ГА связан с секрецией IL-4, IL-10 и других противовоспалительных цитокинов в обоих типах Т-клеток (сдвиг баланса фенотипа клеток Th1 к Th2) и в моноцитах, что приводит к сдвигу в образовании в моноцитах вместо IL-12 обладающего противовоспалительными свойствами IL-10. Например, моноциты мышей, получавших ГА, вырабатывали больше IL-10, чем моноциты мышей, не получавших препарат [3], а моноциты, полученные от пациентов с РС, получавших ГА, синтезировали больше IL-10 в сравнении с пациентами, не получавшими препарат [4]. Кроме того, в дендритных клетках, обработанных ГА во время дифференцировки, увеличивалась выработка IL-10 [17].
Другой противовоспалительный ген IL-1RN (кодирующий IL-1Ra, ингибирующий активность обладающих провоспалительными свойствами IL-1α и IL-1β) продемонстрировал повышенную экспрессию во всех 3-х временных точках. Эти наблюдения соответствуют результатам исследования, показывающим, что уровень растворимого белка IL-1-Ra в крови повышался после введения ГА пациентам с РС и мышам с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЭАЭ), а также то, что уровень растворимого IL-1-Ra увеличивался в моноцитах человека после стимуляции ЛПС или активации за счет контакта с Т-клеткой [6].
Оригинальный ГА вызывал значительную модуляцию во многих биологических путях. Через 6 ч к путям со значительным увеличением числа генов с повышенной экспрессией относились обширные их категории, включая гены иммунного ответа и участвующие в регуляции иммунных процессов, а также во взаимодействии цитокиновых рецепторов. К другим путям со значительным повышением экспрессии генов относятся клеточная адгезия, а также иные пути, участвующие в патогенезе заболевания и/или предполагаемом механизме действия ГА. Значительное увеличение экспрессии генов в моноцитах пациентов с РРС наблюдали также в некоторых путях, изменяющихся под действием ГА [18].
При сравнении эффектов ГА с Пробиоглатом наблюдались значимые различия экспрессии генов (табл. 2). В нашем исследовании была доступна только 1 серия Пробиоглата для сравнения с 4-мя сериями ГА, что исключает возможность влияния вариации партий на исследование. Однако диапазон вариаций, отмеченный между 4-мя сериями ГА, соответствует диапазону вариаций, безопасность и эффективность которого доказаны в ходе клинических испытаний Копаксона. Тот факт, что результаты изучения 1 серии Пробиоглата выходят за пределы данного диапазона, а также отсутствие достоверных фармакокинетических или фармакодинамических маркеров определения эквивалентности 2-х глатирамоидов требуют дальнейшего изучения. Достоверные подтверждающие результаты, полученные при анализе 1 набора зондов, пути и независимой кПЦР, являются особенно надежными с учетом строгих статистических рамок. Следует отметить, что количество генов со значительной модуляцией экспрессии при сравнении ГА и Пробиоглата было меньше, чем при сравнении ГА с маннитолом, что обусловлено структурным сходством соответствующих образцов. Действительно, модуляция экспрессии многих генов под действием ГА и Пробиоглата проходила в одном направлении в сравнении с контролем, но в различной степени (в случае со многими нижеперечисленными генами, если не указано иное). Важно отметить, что значимые различия между ГА и Пробиоглатом наблюдались в экспрессии генов, связанных с соответствующей этиопатофизиологией заболевания и известным в определенной степени механизмом действия ГА. К ним можно отнести ряд генов, связанных с важными функциями иммунной системы, в частности воспалением: CCL5, CCL2, MMP9, MMP1, CXCL10, CD14, ICAM1 и BIRC3. Модуляция экспрессии некоторых из этих генов при лечении пациентов ГА указана в литературных источниках (см. ниже).
Наблюдалась повышенная экспрессия гена CCL5 (RANTES), кодирующего хемокин, который предположительно привлекает иммунные клетки в ЦНС под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч (значение p с коррекцией ЛПР 0,018, КИ 1,09 при анализе экспрессии генов; значение p 4e-5, КИ 1,12 при подтверждении кПЦР). В действительности ген, блокирующий антитела CCL5, снижал параметры заболевания, включая иммунную инфильтрацию в ЦНС в вирусной модели РС [19]. Экспрессия рецептора CCL5, CCR5 в ГА-реактивных T–клетках пациентов с РС снижалась при длительном (1 год) приеме ГА [20]. Данный ген был протестирован, и было подтверждено повышение его экспрессии под действием Пробиоглата в сравнении с ГА в первичных моноцитах человека (p<0,029, КИ 1,53). Экспрессия другого гена провоспалительного цитокина – CCL2 (MCP-1) также была значительно выше для Пробиоглата в сравнении с ГА (значение p с коррекцией ЛПР 0,003, КИ 1,25). Экспрессия CCL2 уменьшалась при применении ГА в сравнении с контролем (маннитолом) и снижалась в меньшей степени при применении Пробиоглата в сравнении с контролем (маннитолом). Считается, что CCL2 привлекает воспалительные клетки в ЦНС при ЭАЭ и РС [21]. Также подтверждено повышение регуляции экспрессии данного гена под действием Пробиоглата в сравнении с ГА в первичных моноцитах человека (p<0,009, КИ 1,24).
Экспрессия гена MMP9 была значительно выше под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч (значение p с коррекцией ЛПР 2,8e-6, КИ 1,29 в анализе экспрессии генов, рис. 4a; значение p 0,02, КИ 1,24 при подтверждении кОТ-ПЦР) и через 24 ч (значение p с коррекцией ЛПР 0,004, КИ 1,25). Наблюдалась также повышенная экспрессия гена MMP9 под действием Пробиоглата в сравнении с ГА в первичных моноцитах человека (p<0,009, КИ 1,4). Данный ферментный белок увеличивает поступление иммунных клеток в ЦНС, способствуя нарушению проницаемости гематоэнцефалического барьера, при этом высокий уровень MMP9 обычно связан с РС [22–24]. Повышенный уровень MMP9 наблюдался у пациентов с очагами, накапливающими Gd-контраст, в сравнении с пациентами без данных очагов [25]. MMP9 предложен в качестве биомаркера при диагностике и прогрессировании РС [26]. ГА ингибирует экспрессию MMP9 в мононуклеарных клетках периферической крови здоровых людей (МКПК) [27].
Уровень экспрессии MMP1, другого гена ММР, повышался под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч (значение p с коррекцией ЛПР 0,002, КИ 1,50 в анализе экспрессии генов; значение p 0,02, КИ 1,25 при подтверждении кОТ-ПЦР). ММР участвует в выделении провоспалительных цитокинов и хемокинов, участвующих в регуляции воспаления [28]. Наблюдаемый уровень мРНК MMP1 и секретируемого MMP1 был выше в незрелых дендритных клетках пациентов с РС в сравнении с контрольной группой здоровых участников [24].
Экспрессия гена хемокина CXCL10 увеличилась под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч (значение p с коррекцией ЛПР 0,0006, КИ 1,46 в анализе экспрессии генов; значение p 0,0029, КИ 2,28 при подтверждении кОТ-ПЦР). Эти данные подтвердились кОТ-ПЦР в первичных моноцитах человека, где наблюдалось повышение регуляции CXCL10 под действием Пробиоглата в сравнении с Копаксоном, значение р <0,02, КИ 2,1. Уровень CXCL10 в периферической жидкости связан с иммунным ответом носителя, в частности в отношении клеток Th1 [29]. CXCL10 участвует в привлечении CD8+ и Th1 CD4+эффекторов T-клеток в очаг воспаления [30]. Исследование с использованием моноцитов пациентов с РРС продемонстрировало, что CXCL10 увеличивается при применении ГА в течение первых 2-х мес. лечения [18].
Наблюдалась повышенная экспрессия гена CD14 в моноцитах человека под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч (значение p с коррекцией ЛПР 0,006, КИ 1,17; рис. 4b). Модуляция экспрессии CD14 под действием ГА отсутствовала в сравнении с группой контроля (маннитол). Данный маркер активации моноцитов увеличивает воспалительные ответы [31]. В комплексе с ЛПС-связывающим белком CD14 взаимодействует с ЛПС для его представления в toll-подобном рецепторе (TLR) 4, активируя экспрессию последующих воспалительных генов через NF-κB. CD14 также является корецептором для других TLR и необходим для стимулирования провоспалительных цитокинов через TLR7 и TLR9 в клетках мышей и человека in vitro [32].
Наблюдалась повышенная регуляция экспрессии гена CARD15 (NOD2) под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч (значение p с коррекцией ЛПР 0,02, КИ 1,14), гена, участвующего в иммунном ответе на ЛПС за счет активизации NF-κB. Активация NOD2 при помощи пептидогликана вызывала демиелинизацию ЦНС у крыс [33], а однонуклеотидный полиморфизм в NOD2 влиял на ответы клеток Th2 и Th17 на ОБМ при РС [34].
Экспрессия гена ICAM1 увеличивалась под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч (значение p с коррекцией ЛПР 0,004, КИ 1,41; рис. 4c). ICAM1 является адгезивной молекулой, которая играет ключевую роль в воспалительных процессах (способствуя адгезии лейкоцитов к эндотелию сосудистой стенки), а также в инфильтрации воспалительных клеток в ЦНС при ЭАЭ и РС [35]. У мышей без ICAM1 T-клетки производили значительно меньше интерферона-γ и показали снижение инфильтрации в спинном мозге [36]. В МКПК пациентов с РРС уровень ICAM1 был выше в сравнении с контрольной группой здоровых участников, а длительный прием ГА повлиял на уровень поверхностного ICAM1 во множественных типах иммунных клеток [37].
Экспрессия BIRC3 увеличилась под действием Пробиоглата по сравнению с ГА через 6 ч (значение p с коррекцией ЛПР 0,018, КИ 1,26). Данный ген кодирует ингибитор белка апоптоза (IAP-1), который помимо своей роли в выживании клетки влияет на врожденный иммунитет [38] и воспаление [39] и может оказывать иммуномодулирующее действие при аутоиммунной демиелинизации [40]. IAP, включая IAP-1, необходимы для производства провоспалительных цитокинов посредством различных путей, включая активацию TLR4 [41] и активацию NOD2 через TNF-α [42].
Повышенная экспрессия генов (значение p с коррекцией ЛПР <0,05) под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч свидетельствует о значительном количественном увеличении соответствующих белковых продуктов (значение p с коррекцией Бенджамини <0,05) для 106 сигнальных путей, указанных в базах данных GO (Биологический процесс, клеточный компонент и молекулярная функция) и Kegg (рис. 3a) [43, 44]. Как указано выше, задействованы сигнальные пути ряда процессов в иммунной системе (GO:0002376) и иммунного ответа (GO:0006955). Некоторые пути связаны с воспалением (например, регуляция воспалительного ответа (GO:0050727) и регуляция выработки TNF (GO:0032680)). Сигналы NOD-подобных рецепторов (hsa04621) регулируют воспалительные и апоптические ответы. Ответ на путь ЛПС (GO:0032496; рис. 3b) включает гены CD14, CCL5, THBD, CARD15, NFKBIA и CCL2 с повышенной экспрессией каждого под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч. Для данного сигнального пути также наблюдалось значительное количественное увеличение в наборах зондов с повышенной регуляцией под действием ГА через 6 ч, но уровень этого увеличения был ниже (14,8 в сравнении с 2,7), а значение р – выше (0,00087 в сравнении с 0,036). Полученные результаты для данного прототипичного провоспалительного пути в случае применения Пробиоглата в сравнении с ГА требуют проведения дальнейших исследований безопасности.
Экспрессия CCL2 (p<0,009), CCL5 (p<0,029), CXCL10 (p<0,020), MMP9 (p<0,009) и IL-1RN (p<0,013) была выше под действием Пробиоглата в сравнении с ГА.
Интересно отметить, что приблизительно для половины сигнальных путей (58 из 114) со значительным увеличением продукции белковых продуктов (значение р с коррекцией Бенджамини <0,05) среди генов с повышенной экспрессией под действием ГА в сравнении с контролем (маннитол) через 6 ч также наблюдалось значительное увеличение образующихся белковых продуктов среди генов с повышенной регуляцией под действием Пробиоглата в сравнении с ГА. Это указывает на то, что многие эффекты, характерные для ГА, достигаются Пробиоглатом в иной степени. Каким образом это повлияет на эффективность дженерика у пациентов, неизвестно, должна быть проведена ее оценка в соответствующих условиях. Кроме того, наблюдалось значительное обогащение 48 сигнальных путей среди генов с повышенной экспрессией под действием Пробиоглата в сравнении с ГА (при отсутствии модуляции под действием ГА в сравнении с контролем маннитолом). К ним относятся сигнальные пути, связанные с воспалением, например, регуляция выработки TNF, сигнальный путь NOD-подобного рецептора и ответ на молекулы бактериального происхождения (GO:0002237), а также другие иммунные пути, включая регуляцию лимфоцит-опосредованного иммунитета (GO:0002706) и пролиферации B-клеток (GO:0042100).
В то время как регуляция экспрессии провоспалительных генов и сигнальных путей значительно повышается под действием Пробиоглата в сравнении с ГА, ряд противовоспалительных генов имел различную экспрессию при введении Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч.
Экспрессия HSPD1, также известного как HSP-60 (белок теплового шока 60 кДА 1), снизилась под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч (значение p с коррекцией ЛПР 0,01, КИ-1,31). Zanin-Zhorov et al. [45] продемонстрировали, что HSP60, а также синтетический пептид, полученный из HSP60, действуют как ко-стимуляторы противовоспалительных Treg через сигнальный путь TLR2, на основании чего можно сделать вывод о том, что HSP60 может снижать регуляцию адаптивных иммунных ответов за счет повышения популяции Treg.
Экспрессия CISH, также известного как SOCS (супрессор сигналов цитокинов), была ниже под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч (значение p с коррекцией ЛПР 0,03, КИ-1,09; рис. 4d). Родственный белок SOCS3 в миелоидных клетках защищал от ЭАЭ – мышиной модели РС путем инактивации нейровоспалительных ответов [46]. Однонуклеотидный полиморфизм в SOCS1, другом члене семейства, считается фактором риска РС [47].
Однако следует отметить, что экспрессия противовоспалительного гена цитокина IL-10, связанного с механизмом действия ГА, также повышена под действием Пробиоглата в сравнении с ГА через 6 ч (значение p с коррекцией ЛПР 0,005, КИ 1,28). Такое же наблюдение сделано для другого гена через 6 и 12 ч, PRDM1 (Blimp1) (значения p с коррекцией ЛПР 0,0006 и 7.7e-6, КИ 1,31 и 1,31 соответственно), при удалении которого возникает воспалительная патология [48]. Blimp1 является мишенью FOXP3 и необходим для выработки IL-10 в клетках Treg, его экспрессию также могут стимулировать IL-2 и провоспалительные цитокины в Treg [49]; неизвестно, как эти наблюдения повлияют на АПК, например, моноциты. Возможно, более высокий уровень Blimp1 может оказывать защитное действие в условиях воспалительной среды. Статистически значимое различие для этого важного в механизме действия ГА гена в любом направлении между 2-мя предположительно идентичными препаратами требует проведения дальнейших исследований.
Концентрации белка, протестированные в рамках того же эксперимента во временной точке 24 ч, соответствовали результатам уровня мРНК, что подтверждает полученные результаты и указывает на связанное с воспалением биологическое воздействие на уровне продукции белков. В независимом дополнительном исследовании на первичных моноцитах человека были изучены 9 воспалительных и связанных с РС генов с использованием кОТ-ПЦР, что позволило обнаружить статистически значимое повышение экспрессии 5-ти из этих генов под действием Пробиоглата в сравнении с ГА. К ним относится ген IL-1RN, связанный с механизмом действия Копаксона. Кроме того, наблюдалось значительное последовательное повышение экспрессии генов CCL2, CCL5, CXCL10 и MMP9 на уровне мРНК и белка в клетках THP-1, что также подтверждено кОТ-ПЦР в первичных моноцитах человека. Данные гены действуют в провоспалительных сигнальных путях и считаются связанными с чувствительностью и тяжестью РС, как указано выше.
Описанная комплексная картина профилей геномной экспрессии подчеркивает сложную взаимосвязь между иммунными процессами, влиянием терапии на соответствующие сигнальные пути и различными ответами каждого типа иммунных клеток. В соответствии с имеющимися данными для других систем и типов клеток [11, 50] наблюдаются последовательные отличия между ГА и глатирамоидами, полученными другими производителями, хотя их характер зависит от биологического контекста тестируемой модели. Кроме того, многие из этих различий влияют на молекулы, связанные с механизмом действия препарата и этиопатогенезом РС, в частности с воспалительным профилем экспрессии. Для генов со значительным повышением экспрессии под действием Пробиоглата в сравнении с ГА наблюдалось значительное повышение продукции белков, принимающих участие в воспалительных реакциях, к ним относились ключевые провоспалительные гены.
Данные результаты выявили значимые различия, которые требуют дальнейшего исследования, в частности в свете наблюдаемых клинических эффектов при клиническом применении Пробиоглата. Программа поддержки пациентов компании «Тева» в Мексике регистрировала число нежелательных явлений, в т. ч. в течение 2012 и 2013 гг., для которых отслеживалось сопоставимое число пациентов (1618 пациентов в 2012 г.; 1552 – в 2013 г.). Пробиоглат впервые начали применять в январе 2013 г.; после этого в рецептах для пациентов мог указываться Пробиоглат либо ГА. В 2013 г. в сравнении с 2012 г. (когда производился только оригинальный ГА) число нежелательных явлений и обострений РРС увеличилось более чем в 3 раза (со 125 до 380) и в 7 раз (с 8 до 59) соответственно, что указывает на статистически значимый рост (p<2,2e-29 и p<3e-11 соответственно). В этой связи наблюдаемые различия в экспрессии генов требуют подробного изучения в рамках исследований по сравнению ГА и заявленных дженериков в соответствующих условиях, предпочтительно включая клинические исследования.
Методы
Расчет статистической мощности и дизайн эксперимента. Был проведен расчет статистической мощности с использованием пакета R ssize.fdr, чтобы определить число образцов, необходимое для выявления генов с различной экспрессией с КИ между препаратами 1,3 при мощности 80%. На основании данных расчетов мощности был разработан дизайн эксперимента, который включал 6 реплик для каждого состояния. Порядок обработки образцов был рандомизирован относительно препарата во избежание возникновения смешиваемого эффекта партии.
Обработка клеточной линии и РНК. Клетки линии моноцитов человека (THP-1) стимулировали оригинальным ГА, заявленными дженериками различных производителей, включая Пробиоглат производства компании «Пробиомед», или растворителем (маннитол) в течение 6, 12 или 24 ч. Выделяли РНК и составляли профиль экспрессии для всего генома при помощи чипа Affymetrix U133 Plus 2.0. Действие 4-х серий ГА и 1 серии Пробиоглата сравнивали в 6-ти биологических репликах. Данные микроматричного анализа помещали в базу данных Gene Expression Omnibus (GEO, GSE68527).
Коррекция партии. Применяли коррекцию вариации партий с использованием ComBat51 в пакете SVA R [52]. Этикетки препаратов добавили в качестве ковариат для коррекции серии, чтобы сохранить значимые эффекты терапии. Анализ главных компонентов показал, что основной эффект в PC1 сохранялся в связи с терапевтическими эффектами после коррекции серии.
Анализ дифференциальной экспрессии. Были выявлены наборы зондов с различной экспрессией в разных условиях с использованием линейных моделей данных микроматричного анализа (LIMMA). При сравнении ГА и заявленного для сравнения дженерика скорректировали по контролю с маннитолом (т. е. [ГА в сравнении с маннитолом] сравнили с [заявленным дженериком в сравнении с маннитолом]). Для использования в анализе сигнальных путей наборы зондов отфильтровали по присутствию на чипе для соответствующих образцов сравнения (например, для регистрации наличия в конкретной временной точке набор зондов должен иметь среднее/пограничное значение присутствия в соответствующих образцах в данной временной точке). Наборы зондов были связаны с генами при помощи маркировки чипа U133 Plus 2.0 от Affymetrix. Значения р с коррекцией ЛПР для генов представляют минимальные значения р с коррекцией ЛПР для имеющихся наборов зондов для данного гена.
Анализ обогащения путей. Гены с повышенной и пониженной экспрессией анализировали отдельно на предмет увеличения продукции белковых продуктов сигнальных путей при помощи метода DAVID15. Результаты анализа представлены на графиках рассеяния с логарифмом значений р в сравнении с уровнем обогащения. В механизме действия ГА для получения перечня генов соответствующего размера (десятки-сотни) для использования в методе DAVID применяли порог КИ абсолютных значений 1,5 и порог значения р 1e-5 для получения списков генов через 6 ч. При сравнении ГА и Пробиоглата гены с повышенной или пониженной экспрессией со значением р с коррекцией ЛПР <0,05 использовали для оценки уровня продукции белков, участвующих в функционировании сигнальных путей.
Полную версию статьи читайте в PDF.
