Судороги и судорожные синдромы могут трансформироваться в различные доброкачественные и резистентные эпилептические синдромы и влиять на нервно-психическое развитие, что представляет важную проблему в медицине. В последние годы отмечается значительный интерес к поиску противосудорожных лекарственных средств, которые обладали бы менее выраженными нежелательными эффектами на организм. Перспективным представляется изучение микронутриентов, способных потенцировать действие противосудорожных средств. Установлено, что миоинозитол необходим для функционирования и возбуждающих, и тормозящих нейротрансмиттеров, он принимает участие в передаче сигнала от рецепторов ацетилхолина, глутамата, γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), гистамина, в обеспечении транспорта липидов и процессов метаболизма веществ в нервной ткани [1, 2]. Все это позволяет предположить, что миоинозитол способен влиять на эффективность противосудорожных средств [3]. Комбинированный препарат инозита и фолиевой кислоты (инозит+ФК) является донором инозита для организма, в состав препарата входят 1000 мг миоинозитола и 100 мкг фолиевой кислоты.
Цель исследования – изучить нейротропные эффекты миоинозитола и фолиевой кислоты в эксперименте. Задачи исследования: определить влияние микронутриентной дотации инозитола и фолиевой кислоты на выраженность и тяжесть течения первично-генерализованных судорог, вызванных тиосемикарбазидом, у крыс и эффективность противосудорожных средств; оценить возможность коррекции микронутриентного статуса препаратом инозит+ФК, содержащим миоинозитол, и изучить его нейропротективное действие.
Материал и методы
Исследование проведено на 42 белых крысах-самцах массой 200−300 г. Животные были разделены на 7 групп: 1-я группа (n=6) − контроль (интактная) 2-я (n=6), – группа контроля с воспроизведением первично-генерализованных судорог; 3-я (n=6), 4-я (n=6) и 6-я (n=6) группы животных получали препарат инозит+ФК в дозе 0,3 г/кг массы тела внутрижелудочно в течение 18 дней (состав препарата: 1000 мг инозитола и 100 мкг фолиевой кислоты), 4-я и 5-я (n=6) группы получали препарат габапентин в дозе 300 мг/кг массы тела внутрижелудочно за 90 мин до воспроизведения судорог, 6–я и 7-я (n=6) группы получали препарат вальпроат натрия в дозе 50 мг/кг массы тела внутрижелудочно в течение 4-х дней. Для определения противосудорожных свойств вещества воспроизводят экспериментальные модели первично-генерализованной эпилепсии, включающие судороги, вызванные электрическим и химическим воздействием [4]. Нами во всех экспериментальных группах воспроизводилась модель судорог введением внутрибрюшинно тиосемикарбазида в дозе 28 мг/кг массы тела. При этом регистрировались латентное время до первого судорожного приступа, количество, характер судорог (вздрагивание, манежный бег, клонические судороги, тонико-клонические судороги с боковым положением, тоническая экстензия, тоническая экстензия, заканчивающаяся гибелью) и летальность в течение 90 мин. После одномоментной декапитации собиралась кровь. Определение содержания миоинозитола в плазме крови экспериментальных животных на 18-й день исследования проводилось микробиологическим методом с помощью тест-системы VitaFast®Inositol (в испытательной лаборатории ООО «Компания Стайлаб»). Данная методика предполагает определение содержания миоинозитола по интенсивности метаболизма и роста тестовой культуры дрожжей Saccharomyces cerevesiae в формате микротитровального планшета. Интенсивность роста S. cerevesiae находится в прямой зависимости от содержания миоинозитола в питательной среде. Для обработки результатов использовалось коммерческое программное обеспечение RIDA®SOFT Win. Проводили патогистологическое исследование секционного материала (головного мозга). Окрашивание микропрепаратов выполняли гематоксилином и эозином. Дубликаты срезов были импрегнированы серебром с помощью набора реактивов компании «Биовитрум». Морфометрическое исследование гистологических срезов проводилось на анализаторе изображения BioVision (Австрия) и заключалось в подсчете поврежденных нейроцитов пирамидного слоя коры полушарий переднего мозга в 10 различных полях зрения с последующей статистической обработкой результатов. Микрофотографии получены с помощью исследовательского микроскопа Micros и цифровой окулярной камеры DCM 900. Статистическая обработка данных производилась с помощью программы Statistica 6.0.
Результаты и их обсуждение
Результаты проведенного исследования показали, что курсовое введение препарата инозит+ФК в указанной дозе на модели тиосемикарбазидовых судорог достоверно увеличило латентное время до первого судорожного приступа и уменьшило тяжесть судорожных приступов (по признаку «манежный бег») (р<0,05) (рис. 1). Летальность животных 3-й группы составила 66,7%, контрольной (2-я группа) − 100%.
При оценке тяжести судорожной активности выявлено, что у животных, которые получали противосудорожный препарат габапентин в указанной дозе на модели тиосемикарбазидовых судорог, достоверно удлинялось латентное время до первого судорожного приступа (р=0,04), уменьшилось количество судорожных приступов (р=0,02) по сравнению с контрольной группой и группой, получавшей вальпроат натрия (рис. 2).
Летальность в группе габапентина составила 0%. Сочетание инозита+ФК и габапентина достоверно снизило тяжесть судорожных приступов (по признаку «тоническая экстензия, заканчивающаяся гибелью») (р=0,02) по сравнению с контролем (рис. 3). Однако летальность в 4-й группе достигла 17%.
В группе крыс, которым вводили вальпроат натрия, при оценке тяжести судорог достоверных изменений показателей по сравнению с контролем не наблюдалось. Однако летальность в этой группе составила 83,3%. В группе животных, получавших комбинацию инозита+ФК и вальпроата натрия, значимо увеличилось латентное время до первого судорожного приступа по сравнению с контрольной группой (р=0,003), группой, получавшей вальпроат (р=0,03), и группой, получавшей инозит+ФК (р=0,004) (рис. 4). Летальность животных данной группы составила 50%.
Возникновение первично-генерализованных судорог при введении тиосемикарбазида связано с уменьшением содержания в мозге ГАМК вследствие торможения активности фермента декарбоксилазы глутаминовой кислоты. вальпроат натрия как противоэпилептическое средство активирует фермент, катализирующий образование ГАМК, и ингибирует фермент инактивации ГАМК. В итоге вальпроевая кислота способствует значительному накоплению ГАМК в головном мозге. Антиконвульсант габапентин используется для лечения эпилепсии, а также нейропатической боли. В терапевтических концентрациях габапентин непосредственно открывает ионные каналы для ионов калия, не связывается с ГАМК, бензодиазепиновыми, глициновыми рецепторами и NMDA-рецепторами. Однако габапентин обладает способностью усиливать образование ГАМК [5, 6]. Изменение эффективности судорожного вещества и противосудорожных средств под влиянием миоинозитола обусловлено, вероятно, его ГАМК-миметическим действием.
На фоне первично-генерализованных судорог уровень инозитола в крови животных достоверно не изменился (рис. 5). Курсовое введение препарата инозит+ФК значимо увеличило содержание в крови инозитола в 3-й группе наблюдения.
Введение антиконвульсантов габапентина и вальпроата натрия в указанной дозе в 5-й и 7-й исследуемых группах привело к достоверному снижению концентрации инозитола в плазме крови по сравнению с группой интактных животных (1-я группа) и с группой воспроизведения первично-генерализованных судорог (2-я группа). Курсовое введение препарата инозит+ФК сохранило и значимо увеличило концентрацию инозитола в плазме крови животных на фоне введения противосудорожных средств − габапентина и вальпроата натрия (4-я и 6-я исследуемые группы). Таким образом, препарат инозит+ФК показал способность восстанавливать дефицит инозитола в плазме крови, вызванный введением противосудорожных средств.
Патогистологическое исследование секционного материала (головного мозга) показало, что во 2-й группе наблюдения, в которой у животных воспроизводилась модель первично-генерализованных судорог, выявлено выраженное нарушение кровообращения на уровне микроциркуляторного русла, равномерно проявляющееся в сером и белом веществе полушарий переднего мозга. В капиллярах явления гемостаза характеризовались агрегацией эритроцитов с выраженным периваскулярным отеком нервной ткани (рис. 6). Полнокровие венул сопровождалось дилатацией их просвета. В коре полушарий выявлены мелкоочаговые периваскулярные кровоизлияния (рис. 7).
Ишемические повреждения нейроцитов коры и подкорковых ядер выражались в исчезновении грануляций Нисля, гомогенизации цитоплазмы с исчезновением контуров ядра, набуханием аксона (рис. 8). Наблюдалась гибель единичных нейроцитов пирамидного слоя коры, сопровождавшаяся размытием границ и увеличением объема цитоплазмы. Импрегнация серебром зон головного мозга, содержащих проводящие пути, показала неравномерную окраску и нечеткость контуров нервных волокон, а также очаговую пролиферацию микроглиальных элементов.
В 3-й группе животных, получавших препарат инозит+ФК внутрижелудочно в течение 18 дней, после воспроизведения судорог расстройства кровообращения в микроциркуляторном русле характеризовались гемостазом в капиллярах и умеренно выраженным перикапиллярным отеком нервной ткани коры и белого вещества переднего мозга. Спастическое состояние интрацеребральных и пиальных артерий зарегистрировано лишь в 2-х наблюдениях. Значительная часть нейроцитов коры и подкорковых ядер на микроскопическом уровне не имела структурных повреждений, в состоянии гомогенизации находились единичные нервные клетки при фактическом отсутствии погибших (некротизированных) нейронов (рис. 9). Импрегнация серебром проводящих путей головного мозга в большинстве наблюдений обусловила сохранность миелиновых оболочек нервных волокон, которые имели четкие контуры (рис. 10).
В целом патогистологическое исследование секционного материала (головного мозга) показало, что использованная модель первично-генерализованных судорог имела морфологическое подтверждение во всех случаях наблюдения. Применение препарата инозит+ФК в течение 18 дней минимизировало уровень ишемического повреждения нейроцитов. Морфометрический анализ показал, что в 3-й группе наблюдения, получавшей препарат, количество поврежденных нервных клеток коры составило 31,5%, в сравнении со 2-й группой, где количество поврежденных клеток было на уровне 49,8% при достоверных морфологических признаках гибели нейроцитов. При превентивной терапии препаратом инозит+ФК повреждения нервных волокон головного мозга оказались минимальными (данное заключение требует дальнейшего изучения).
Выводы
Таким образом, препарат инозит+ФК, содержащий миоинозитол и фолиевую кислоту, модулирует эффекты лекарственных средств, обладающих как судорожным, так и противосудорожным действием. Инозит+ФК уменьшает тяжесть и длительность судорог, вызванных тиосемикарбазидом, увеличивает выживаемость животных. Усиливает противосудорожное действие вальпроата натрия и, в меньшей степени, габапентина, что, вероятно, связано с разными точками приложения действия лекарственных средств. Инозит+ФК повышает обеспеченность организма инозитолом и восполняет его дефицит, вызванный антиконвульсантами. Инозит+ФК оказывает нейропротективный эффект на клетки коры головного мозга в условиях ишемии, вызванной судорогами, обеспечивая сохранность органелл цитоплазмы нейроцитов.
