методами микробиологической диагностики в настоящее время остаются культуральные методы. Однако их недостатками являются длительность исследования, высокие требования к забору материала, повышенные требования к квалификации персонала лабораторий. В реальной клинической практике у врача, сталкивающегося с тяжелой инфекцией глаз, часто нет времени для ожидания результатов, ему требуются минимально затратные по времени методы диагностики для адекватного подбора этиотропной терапии. Бурное развитие молекулярной биологии и техники значительно расширило возможности диагностики инфекций глаз.
К основным некультуральным методам подтверждения диагноза грибкового кератита на сегодняшний день относятся прямая микроскопия образца, полученного с очага поражения, конфокальная микроскопия роговицы, а также современные молекулярные методы исследования. Ценным дополнительным методом диагностики может быть оптическая когерентная томография переднего отрезка глаза.
Прямая микроскопия
Самым быстрым методом выявления возбудителя в образце является метод прямой микроскопии с применением различных методов окраски [5—8]. Полезными могут быть также методы окрашивания Шифф-йодной кислотой [9, 10] и акридиновым оранжевым [11], модифицированный метод окраски по Цилю — Нильсену [12] и др. [10, 13, 14].При микроскопии образца оцениваются вид мицелия, конидии (для грибов-конидиеносцев), гифы и их взаиморасположение с оплодотворяющими органами грибов. Существует ряд трудностей, с которыми можно столкнуться при идентификации этиологического агента с помощью прямой микроскопии образца. Основными сложностями данного метода являются неверная интерпретация результатов, наличие артефактов, редкое выявление грибов рода Candida и других дрожжеподобных грибов [15—17]. Также метод прямой микроскопии требует обязательного предварительного окрашивания. Если в образец не были добавлены специальный контраст или красящий агент, то грибы будут визуализироваться как бесцветные структуры на окрашенном фоне, их идентификация будет затруднена [17—19].
Основными материалами, служащими источником для прямой микроскопии, являются:
стерильный материал на ватном тампоне или мазок, собранный посредством оттиска кальциевой альгинатной массой, с конъюнктивы и век обоих глаз [20];
соскоб с роговицы, собранный с помощью шпателя Kimura, лезвием Bard — Parker, стерильным бритвенным лезвием, хирургическими лезвием или шпателем. Манипуляции проводятся под местной анестезией [20, 21]. Материал для микроскопии собирают с основания и краев язвы;
контактные линзы, контейнеры для линз и многофункциональный раствор для линз [22];
материал роговицы, полученный при выполнении сквозной или послойной кератопластики [1, 15];
биоптат роговицы [23, 24].
Биопсия роговицы может быть эффективнее соскобов при глубоком расположении инфильтрата в строме роговицы и отсутствии обширного эпителиального дефекта [23, 24].
Чувствительность и специфичность метода прямой микроскопии достигают 90% [25, 26].
Рассмотрим подробнее основные методы окрашивания для исследования методом прямой микроскопии.
Фиксация раствором гидроксида калия
По данным разных авторов, чувствительность метода составляет 71% [27], 81% [8, 15], 90—91% [5]. Специфичность микроскопии с фиксацией гидроксидом калия — 83,8% [8]. Данный метод является экономичным, требующим всего одного-двух этапов подготовки. К преимуществам использования гидроксида калия относится прокрашивание даже толстых образцов роговицы, что обеспечивает контрастность грибковой структуры относительно фона [17]. Метод фиксации раствором гидроксида калия с последующей микроскопией позволяет получить результат уже через 10—15 мин от момента взятия образца материала [16].К недостаткам метода относится достаточно большая частота выявления артефактов [27]. Клетки толстого образца роговицы могут быть недостаточно прозрачными для точной микроскопии. Окрашивающийся гидроксидом калия препарат имеет короткий срок годности. Оптимальным временем для исследования является период в пределах 12—18 ч с момента взятия образца [17].
Грибы-филаменты визуализируются как отражающие свет гифы, с перегородками или без них. Гифы могут быть одинарными или разветвленными. Для феоидных грибов характерен коричневый цвет филаментов, появляющийся вследствие накопления меланина в клеточной стенке. Дрожжи и дрожжеподобные грибы имеют овальную или круглую форму, часто обесцвечены. Возможно образование псевдогифов, которые необходимо дифференцировать с клетками эпителия [28].
Метод окраски по Граму
По данным различных авторов, чувствительность метода окраски по Граму колеблется от 36 до 73% [2, 6, 21, 26]. Специфичность метода составляет 84,9% [26]. Окрашивание по Граму позволяет хорошо визуализировать как клетки дрожжеподобных грибов, так и гифы грибов-филаментов. В случае микст-инфекции бактерии также могут быть идентифицированы в материале. Для получения результата требуется от 15 до 30 мин [16].К недостаткам метода относится неравномерная окраска цитоплазмы гифов грибов. Метод неэффективен при окрашивании толстых образцов взятого материала. Возможно наличие ложноположительных результатов вследствие возникновения артефактов. Кроме того, преципитаты краски могут привести к неправильной интерпретации результатов [17].
Грибы-филаменты подразделяются на грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные нитчатые грибы представляются фиолетовыми (синими), грамотрицательные — розовыми. Все дрожжеподобные грибы являются грамположительными, имеют овальную или округлую форму [28].
Метод окраски по Гимзе
Чувствительность метода оценивается от 39,7% [15] до 66% [29].При окрашивании по Гимзе приобретает цвет только цитоплазма клетки, клеточная стенка остается интактной. Споры выглядят более мелкими, чем при окрашивании другими методами.
Окрашивание лактофенолом хлопковым голубым
Чувствительность метода составляет 77—82% [6, 8]. Окрашивание лактофенолом хлопковым голубым является быстрым (приготовление препарата занимает 5 мин [6]), простым, недорогим, одноступенчатым методом окраски, который позволяет выявить все основные виды грибов [17]. Окрашивание лактофенолом позволяет также обнаружить наличие цист Acanthamoeba [30]. Метод коммерчески выгоден: краситель имеет длительный срок хранения и может храниться годами [17].Однако лактофенол хлопковый голубой плохо проникает в ткани, что приводит к затруднению в использовании на толстых образцах взятого материала. Контраст между прокрашенным грибом и фоном может быть недостаточным для идентификации, поэтому нетипичные виды грибов могут быть упущены [6, 17].
Гифы и конидии визуализируются черными или темно-коричневыми на голубом фоне [28].
Окрашивание красителем метенамин-серебро по Гомори
Чувствительность метода составляет 85—86% [16, 21]. Клеточные стенки грибов и перегородки ярко очерчены и хорошо видны на бледном фоне, что повышает вероятность идентификации вида гриба. Элементы гриба окрашиваются в цвет от серебристого до черного и хорошо видимы в слое образца ткани [28]. Помимо грибов также могут идентифицироваться цисты Acanthamoeba и Pneumocystis carinii [17].Недостатком такого метода является избыточное депонирование серебра в тканях, что может скрывать детали морфологии гриба. Прокрашивание клеточных включений и меланина может давать ложноположительные результаты и неправильную интерпретацию. Реагенты и процедура окрашивания не стандартизированы [17]. Процедура является многоступенчатой, требуя 2—3 ч для подготовки образца [16].
Окрашивание калькофлуором белым
Чувствительность метода составляет 80—90% [5]. Гифы грибов и клетки дрожжей визуализируются хорошо очерченными ярко-зелеными элементами на красно-коричневом фоне [28]. Несомненным преимуществом метода является возможность даже в толстых образцах взятого материала ясно различать детали морфологии грибов. Также могут визуализироваться цисты Acanthamoeba и Pneumocystis carinii [16, 31]. Метод окрашивания является двухэтапным. Время подготовки образца для микроскопии составляет 30 мин [16].Одним из основных недостатков данного метода окраски является обязательное приготовление свежих реагентов перед каждым окрашиванием, в противном случае высока вероятность появления артефактов [32]. Кроме того, требуется наличие сложного оборудования — для визуализации необходимо использование ультрафиолетового микроскопа [16, 17]. Во время проведения микроскопии исследователь должен быть защищен от вредного воздействия ультрафиолета. Реагенты и процедура требуют стандартизации [17].
Оптическая когерентная томография
Оптическая когерентная томография (ОКТ) является современным методом визуализации переднего отрезка глаза. С помощью ОКТ можно проанализировать морфологию нормальной и пораженной инфекцией роговицы. Метод является неинвазивным, что позволяет использовать его не только для постановки диагноза, но и для наблюдения за состоянием роговицы в динамике [33].Стромальные инфильтраты на ОКТ визуализируются гиперрефлексивными зонами в строме. Отек проявляется в виде диффузного утолщения стромы роговицы [34]. Метод ОКТ позволяет осуществлять контроль за толщиной роговицы в случае ее изъязвления или развития стромального отека. В случае экссудации в передней камере глаза воспалительные клетки выявляются в виде гиперрефлексивных плавающих точек или агрегатов на заднем эпителии роговицы, визуализирующихся при биомикроскопии как преципитаты [33]. В исследовании Y. Takezawa et al. (2017) было показано, что у большинства пациентов с грибковым кератитом наблюдается шероховатая линия раздела между задним эпителием и наложениями на нем, тогда как для бактериальных кератитов характерна четкая граница раздела эндотелий — преципитаты, что может служить дополнительным маркером при определении этиологии заболевания [35].
Конфокальная микроскопия
Конфокальная микроскопия (КМ) является методом диагностики in vivo, который позволяет исследовать передний сегмент глаза на различных уровнях и при различном масштабировании (возможно увеличение изображения в 200—500 раз) [36, 37]. Неинвазивность процедуры позволяет проводить повторные исследования для контроля лечения и оценки динамики заболевания [25]. КМ может использоваться для оценки глубоких стромальных инфильтратов роговицы, для которых невозможно проведение микроскопического или культурального исследования [37]. В исследованиях Р. К. Vaddavalli et al. (2011) показано, что чувствительность метода составляет 88,3%, а специфичность — 91,1% [38]. КМ может быть полезна при получении пациентами активной антимикотической терапии, т. к. в этих случаях чувствительность культурального метода значительно снижается [38].Различные виды и роды этиологических агентов имеют особенности визуализации при проведении КМ. Так, грибы родов Fusarium и Aspergillus представляются в виде высококонтрастных элементов шириной от 3 до 8 мкм и длиной 200–300 мкм [39]. Они имеют перегородки и двойной контур, постоянную форму и ширину, несимметричные ответвления. Обычно грибы-филаменты выглядят яркими линейными структурами, стенки которых параллельны друг другу [17, 38, 40]. Виды филаментов различаются между собой углом ветвления гифов: например, для грибов рода Fusarium характерен угол 90о, для рода Aspergillus — угол 45о [39]. Грибы рода Candida отличаются своими псевдогифами [41]. Они имеют вид высококонтрастных, удлиненных частиц длиной 10—40 мкм и шириной 5–10 мкм [39].
Помимо возбудителя заболевания с помощью КМ визуализируются воспалительные клетки вокруг очага инфекции, а также эпителиальная и стромальная дезорганизация, обусловленная активацией фибробластов [39].
Кроме грибковых частиц при помощи КМ можно выявить нервные волокна роговицы и оценить их состояние. В норме они визуализируются как яркие продолговатые единообразные (нервные волокна) или бусоподобные (суббазальные сплетения) структуры толщиной от 5 до 20 мкм, имеющие ответвления, отходящие под острым углом [37]. При повреждении нервов роговицы развивается нейротрофическая кератопатия, что приводит к дополнительному повреждению роговицы и к образованию в исходе заболевания грубого рубцового помутнения, которое может значительно снижать остроту зрения пациента [42, 43]. Такие дистрофические изменения характерны для течения грибковых кератитов [43].
Стоимость оборудования, низкая доступность метода в рутинной практике, необходимость обучения персонала для верной интерпретации результатов являются значительными ограничивающими факторами для проведения исследования КМ в широкой практике [37].
Молекулярные методы диагностики
К молекулярным методам диагностики грибковых кератитов относятся полимеразная цепная реакция и масс-спектрометрия. Несомненными преимуществами данных методов являются оперативность и высокая точность получения информации об инфекционном агенте.Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является современным методом обнаружения компонентов ДНК инфекционного агента в образце ткани. ПЦР представляет собой ферментативную амплификацию участка ДНК. Для исследования достаточно даже небольшого количества ДНК этиологического агента (10 пг грибов рода Candida, 100 пг грибов-филаментов [44]), что является преимуществом для обнаружения патогенного организма, при культивировании которого возникают трудности. ПЦР-диагностика является быстрым методом диагностики, т. к. требует всего 2,5 ч для получения достоверного результата после извлечения ДНК из образца [45]. Материалами для проведения исследования могут служить: внутриглазная жидкость, слеза, «свежие» ткани глаза, формалин- или парафин-фиксированные ткани, окрашенные или неокрашенные цитологические срезы, из которых может быть получена ДНК [17]. Чувствительность метода ПЦР составляет 94%, специфичность — 64% [22]. Низкая специфичность обусловлена тем, что результат ПЦР может быть положительным даже в том случае, когда микроорганизм нежизнеспособен. Ложноположительные результаты составляют около 3% [2], что всегда нужно иметь в виду при оценке результата. В своем исследовании N. Menassa et al. показали, что у 1—8,3% пациентов без грибкового кератита методом ПЦР выявлялись ДНК различных видов грибов [46]. Тем не менее ПЦР — один из наиболее ценных методов диагностики кератомикозов, т. к. позволяет получить результат в короткие сроки [47, 48], а также может использоваться для обнаружения неспорообразующих грибов [49]. Из-за высокой чувствительности ПЦР-диагностика не может быть использована для оценки динамики заболевания и ответа на терапию вследствие невозможности определить жизнеспособность микроорганизмов. Наконец, при ПЦР можно идентифицировать только того возбудителя, для которого существуют праймеры и имеется известная последовательность ДНК. ПЦР не предоставляет информации о клеточном строении и локализации этиологического агента [50].Из-за высокой стоимости и ограниченной доступности метода ПЦР некоторые авторы рекомендуют выполнять его не сразу при подозрении на грибковый этиологический агент, а в течение 1 нед. при отрицательном результате посева материала на питательных средах [22].
Масс-спектрометрия
Масс-спектрометрия является методом, позволяющим быстро идентифицировать и классифицировать микроорганизмы [51]. В основе метода масс-спектрометрии лежат получение масс-спектра рибосомальных белков исследуемого микроорганизма, являющихся высококонсервативными и видоспецифичными, и сравнение его с масс-спектрами, содержащимися в базе данных. Степень сходства выражается в относительных единицах, что позволяет сделать вывод о принадлежности микроорганизма к тому или иному виду [52].В настоящее время существует три основных подхода к определению протеома клетки: 1) «классическая» стратегия «снизу вверх» основана на разделении белковых фракций c помощью ферментного гидролиза на мелкие фрагменты белковых молекул с последующим масс-спектрометрическим анализом пептидов; 2) метод «панорамной протеомики» основан на ферментном гидролизе комплексов белковых молекул c последующим отщеплением пептидов от ферментов с помощью капиллярного хроматографа или электрофоретического сепаратора; 3) методика «сверху вниз» заключается в масс-спектрометрическом анализе изолированных фрагментированных протеинов, полученных с помощью комплекса процедур очистки [53]. Стоит также отметить, что дрожжеподобные грибы имеют толстую стенку, поэтому для их распознавания необходим дополнительный этап разрушения клеточной стенки, аналогичный с протоколами идентификации бактериальных клеток [54].
Для определения этиологии кератита используют слезу пораженного глаза в качестве исследуемого материала и слезу контрлатерального глаза для контроля [55]. Для подтверждения грибковой этиологии кератита исследуют не только наличие рибосомальных белков и протеинов, выделяемых клеткой гриба в процессе метаболизма (например, количество глутаредоксина и глутаредоксин-связанных протеинов), но и количественное изменение белков слезы человека. Так, для кератомикозов характерны снижение количества прекурсора цистатина S, прекурсора цистатина SN, цистатина, липокалина слезы человека, а также увеличение количества пролактин-индуцированного протеина и прекурсора сывороточного альбумина [55].
Метод масс-спектрометрии является быстрым — результат может быть получен в течение 24 ч с момента взятия материала, что позволяет быстро назначить адекватную терапию. Метод имеет высокую специфичность (97%) и высокую чувствительность — для идентификации необходимо всего 10 пг протеома этиологического агента [56]. Однако одним из основных недостатков метода является отсутствие данных белковых профилей всех возможных микроорганизмов [57]. Это может привести к отрицательному или ложному результату исследования в случае развития кератита, вызванного редкими видами грибов.
Заключение
На сегодняшний день в распоряжении врачей имеется множество путей для оперативной идентификации грибковой инфекции. Тем не менее ни один из представленных методов не является эталонным, и их применение в широкой практике крайне ограниченно.Использование красителей сопряжено с необходимостью организации рабочего места для проведения исследований (особенно при проведении исследований у неотложных пациентов), наличия опыта работы с ними как у офтальмолога, так и у микробиолога.
Инструментальные методы диагностики (ОКТ, КМ) являются неинвазивными и могут использоваться многократно у одного пациента, однако требуют большого опыта от исследователя для верной интерпретации получаемых изображений.
Для молекулярных методов диагностики характерна высокая чувствительность при относительно невысокой специфичности вследствие возможности получения ложноположительных результатов. Однако основными ограничениями их использования на сегодня являются высокая стоимость исследования, необходимость наличия сложного оборудования и обученного персонала. Кроме того, в настоящее время не накоплена база данных ДНК- и белковых профилей всех существующих микроорганизмов, в особенности возбудителей грибковой инфекции.
При использовании единственного метода исследования можно предположить наличие лишь наиболее вероятного возбудителя заболевания. Для наиболее точной верификации предпочтительнее использовать комбинации различных методик в сочетании с традиционными культуральными методами диагностики. Проблема диагностики грибковой инфекции глаз требует дальнейших разработок и совершенствования.
