Нами впервые показана высокая частота метилирования промоторного района гена MGMT при РМЖ (21%, 12/58). Частота метилирования гена RASSF1A (19%, 11/58) при РМЖ сопоставима с опубликованными данными. Впервые установлена достоверная корреляция частоты метилирования генов MGMT и RASSF1A с прогрессией РМЖ (р ≤0,05, по Фишеру). Также нами впервые показано, что при тройном негативном РМЖ происходит увеличение частоты метилирования обоих генов (33 и 40% соответственно). Метилирование промоторных районов этих генов относится к ранним событиям в патогенезе эпителиальных опухолей.
Ключевые слова: ген MGMT, ген RASSF1A, метилирование, промоторная область, CpG-островок, РМЖ.
Принятые сокращения: РМЖ – рак молочной железы; МСП – анализ с использованием метилспецифичной ПЦР; ипРМЖ – инфильтративно-протоковый рак молочной железы. идРМЖ – инфильтративно-дольковый рак молочной железы
Введение
Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее часто диагностируемой онкологической патологией среди женщин во всем мире. Это заболевание характеризуется агрессивным течением, трудностью прогноза исхода болезни и высокой смертностью [1]. В России ежегодно от этого вида опухоли умирают более 20 тыс. человек [2]. Важную роль в патогенезе РМЖ играют эпигенетические нарушения в генах-супрессорах опухолевого роста (TSG), большинство из них являются генами «домашнего хозяйства», обеспечивающими поддержание нормального функционирования клетки, ее защиту от факторов внешней среды и поддержание целостности ее структуры [3]. Эпигенетическая модификация (метилирование) регуляторных участков этих генов нарушает их взаимодействие с факторами транскрипции, блокируя данные участки с помощью белков, специфично связывающихся с метилированными CpG-парами (Methyl-CpG binding proteins) и, кроме того, вносит изменения в окружающий хроматин, переводя его в стабильно репрессированное состояние [4–6]. К таким генам относятся гены-супрессоры RASSF1A и MGMT.
Ген RASSF1A располагается в кластере связанных с канцерогенезом генов в районе 3p21.31 [7]. Белковый продукт гена относится к цитоплазматическим белкам. Выявлено многообразие функций этого белка в клетке, например задержка клеточного цикла в фазе G1/S-перехода, которая влияет на содержание циклина D1 и фосфорилирование белка pRb [8]. Также белок гена RASSF1A вовлечен в индукцию апоптоза и стабилизацию микротрубочек [9]. Метилирование гена RASSF1A в опухолях разной локализации рассматривают как способ подавления его супрессорной функции при онкогенезе [10].
Ген MGMT кодирует фермент O6-метилгуанина-метилтрансферазу, который принимает участие в прямой репарации ДНК. Этот фермент активирует перенос метильной группы от O6-метилгуанина к остатку цистеина, что позволяет восстановить нормальную структуру ДНК после повреждения, вызванного алкильными соединениями [11]. В ряде работ показано, что гиперметилирование CpG-островка гена MGMT ассоциировано с инактивацией его транскрипции и сопровождается перестройкой хроматина в неактивное состояние. Метилирование промоторной области гена MGMT показано для рака толстой кишки и карцином печени [12, 13].
Одними из причин низкой выживаемости больных РМЖ являются бессимптомное течение заболевания на ранних стадиях, отсутствие достаточно эффективной диагностики и устойчивость пациентов к химиотерапии. Известно, что нарушение паттерна метилирования ДНК на всех стадиях канцерогенеза может быть использовано для диагностики и прогноза злокачественных опухолей [14].
В предлагаемой работе представлены результаты изучения метилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT в эпителиальных опухолях молочной железы с использованием метода МСП (метилспецифичная ПЦР с использованием в качестве матрицы конвертируемой бисульфитом ДНК). Определена частота метилирования промоторных районов (т.е. доля образцов, в которых наблюдали метилирование) и показана достоверная корреляция частоты метилирования этих районов с прогрессией РМЖ.
Материалы и методы
Образцы первичных опухолей РМЖ были собраны и клинически охарактеризованы в РОНЦ РАМН. Принципы отбора образцов и выделения высокомолекулярной ДНК описаны ранее [15]. Исследованы парные образцы опухолевой и гистологически нормальной ткани от 58 пациентов с РМЖ (преимущественно инфильтративно-протоковой гистологии, ипРМЖ и идРМЖ). В качестве дополнительного контроля использованы ткани молочной железы от 10 умерших человек, не имеющих в анамнезе онкологических заболеваний.
Бисульфитную конверсию ДНК и метилспецифичную ПЦР (МС-ПЦР) проводили по методу, описанному в работе коллектива авторов из США [16] и России [17]. Для анализа метилирования каждого гена использовали две пары праймеров, специфичных как к метилированному, так и неметилированному аллелю (табл. 1). МС-ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16,7 мМ (NH4)2SO4; 0,01% Tween-20; 1,5 мМ MgCl2; 0,25 мМ каждого dNTP; 10–20 нг ДНК; 25 пмоль каждого праймера; 0,5 ед. Hot Start Taq-ДНК-полимеразы («СибЭнзим», Россия). Праймеры, температура отжига (Тотж) и размеры продукта ПЦР приведены в таблице 1. ПЦР проводили по программе: 95°С, 2 мин.; 35 циклов (92°С, 10 c; Тотж (табл. 1), 25 с; 72°С, 25); 72°С, 3 мин. на амплификаторe DNA Engine Dyad Cycler (Bio-Rad, США). Для каждой пары праймеров проверяли отсутствие продукта ПЦР на неконвертированной ДНК. Образцы ДНК из лейкоцитов крови здоровых доноров использовали как контроль для неметилированных аллелей. В качестве позитивного контроля 100% метилирования использовали препараты ДНК из лейкоцитов, обработанные метилтрансферазой SssI («СибЭнзим», Россия). Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 10% полиакриламидном геле (рис. 1).
Статистический анализ проводили с применением точного критерия Фишера. Уровень значимости принят равным 0,05. Рассматривали также результаты статистически маргинально значимые (0,05<р<0,1), что соответствует доверительному интервалу 94% (в отличие от стандартного доверительного интервала 95% при р=0,05). Расчеты проводили в системе для статистического анализа данных STATISTICA 6.1 RUS.
Результаты и обсуждение
Анализ метилирования CpG-островков, расположенных в промоторных областях генов RASSF1A и MGMT, проводился с помощью МС-ПЦР. На рисунке 2 представлен комплекс данных по анализу метилирования этих генов в 58 случаях РМЖ. Рисунок включает данные с учетом клинико-морфологических параметров опухоли. Для обоих исследованных генов обнаружены более частые случаи метилирования в образцах опухолевой ткани, чем в образцах условно нормальной ткани молочной железы, причем различия статистически значимые (р≤0,05 по Фишеру, табл. 2). Частота метилирования генов RASSF1A и MGMT в образцах РМЖ составляет 19 и 21% соответственно. Следует отметить, что метилирование промоторных районов генов RASSF1A и MGMT в образцах ДНК из гистологически нормальной ткани, прилежащей к опухоли, отмечено не было. Кроме того, анализ образцов ДНК тканей молочной железы 10 доноров без онкопатологии в анамнезе показал полное отсутствие метилирования этих генов (табл. 2). Также нами показано значимое различие по частоте метилирования гена RASSF1A у пациентов с идРМЖ (р=0,035) и условно нормальной, прилежащей тканью. Ген MGMT чаще метилирован у пациентов с ипРМЖ (р=0,015), чем в условно нормальной, прилежащей ткани.
Данные о метилировании промоторных районов генов RASSF1A и MGMT противоречивы и варьируют в широких пределах: от 19 до 87% – для гена RASSF1A и от 8 до 20% – для гена MGMT при РМЖ [20–22]. При этом определенная нами частота метилирования гена RASSF1A при РМЖ весьма близка или совпадает с литературными данными [23, 24]. В то же время нами впервые отмечено значительное повышение частоты метилирования гена MGMT при РМЖ с 8% [25] до 21% у женщин московского региона (в других регионах России подобные исследования не проводились). При этом частота метилирования в опухолях больных с идРМЖ составила 43 и 29% соответственно. Интересно, что результаты мировых исследований выявляют 84% метилирования гена RASSF1A [26]. Данные по распределению частоты метилирования гена MGMT получены впервые. Для больных с ипРМЖ значения частоты метилирования составили 11 и 18% соответственно, что в 8 раз ниже для гена RASSF1A и в 2 раза выше для гена MGMT по сравнению с данными мировых исследований (85 и 9% соответственно) [27].
Наблюдаемые различия в частоте метилирования генов RASSF1A и MGMT могут быть связаны как с чувствительностью использованного метода, так и с этнографическими особенностями западно-европейской, американской и российской (московской) популяций.
Нами также были исследованы возможные корреляции между частотами метилирования генов и различными клинико-морфологическими характеристиками РМЖ: размером опухоли, клинической стадией, степенью дифференцировки и метастазированием. Статистически значимая корреляция с размером опухоли выявлена как для гена MGMT (р=2х10-6), так и для гена RASSF1A (р=0,035). Данная зависимость сохраняется и при анализе ипРМЖ (рис. 3). С переходом от ранних (I + II) к более поздним (III + IV) клиническим стадиям статистически значимо увеличивается частота метилирования как гена MGMT при РМЖ (8% (4/50) против 100% (8/8), р=2х10-6, рис. 3), так и гена RASSF1A (14% (7/50) против 50% (4/8), р=0,035, рис. 3). Кроме того, на более поздних стадиях онкологического процесса при ипРМЖ статистически значимо увеличивается частота метилирования и для гена MGMT, и для гена RASSF1A (рис. 3). Для гена MGMT выявлена значимая корреляция частоты метилирования с потерей дифференцировки при РМЖ (6% (2/35) в высоко- и умеренно-дифференцированных опухолях против 43% (10/23) в низко-дифференцированных опухолях, р=0,0008, рис. 3), также и для инфильтративно-протокового РМЖ (р=0,019, рис. 3). Для гена RASSF1A показана значимая корреляция частоты метилирования с потерей дифференцировки только для РМЖ (р=0,004, рис. 3). Для образцов с РМЖ и его гистологическими типами корреляции с образованием метастазов в регионарных лимфоузлах и других органах найдено не было.
При РМЖ нами было исследовано изменение частоты метилирования генов RASSF1A и MGMT в зависимости от иммуногистохимического статуса опухоли. Было показано, что при тройном негативном РМЖ происходит увеличение частоты метилирования обоих генов (33% (5/15) и 40% (6/15) соответственно). Однако статистически значимое различие показано только для ипРМЖ (36% (4/11) против 3% (1/33), р=0,01, рис. 3).
В ранее проведенных исследованиях метилирования генов RASSF1A и MGMT в опухоли молочной железы данные о связи между метилированием этих TSG и клиническими характеристиками опухолей крайне противоречивы, что может быть связано с различиями в лабораторных и статистических методах, размере выборки, состоянии здоровья самих пациентов.
Нами впервые установлена достоверная корреляция частоты метилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT с различными клинико-морфологическими характеристиками РМЖ. Впервые исследована связь метилирования генов RASSF1A и MGMT и гормонального статуса рецепторов при РМЖ у пациентов московского региона. Полученные нами данные о связи метилирования гена RASSF1A с гормональным статусом рецепторов при РМЖ согласуются с данными других исследований [28, 29].
Все это позволяет рассматривать гены RASSF1A и MGMT как молекулярные маркеры неблагоприятного прогноза [29, 30].
Заключение
Таким образом, в настоящей работе изучено метилирование промоторных районов генов MGMT и RASSF1A у пациенток с РМЖ, проживающих в Москве и Московской области. Показана высокая частота метилирования изученных генов в опухоли молочной железы по сравнению с гистологически нормальной тканью от тех же пациенток. Выявлены значимые корреляции частоты метилирования генов RASSF1A и MGMT с различными клинико-морфологическими характеристиками злокачественного процесса. Впервые показана связь метилирования промоторных районов этих генов с тройным негативным фенотипом при ипРМЖ у жительниц московского региона.
Выявленные особенности могли бы быть использованы для разработки современных подходов к прогнозированию, профилактике и лечению РМЖ у пациенток московского региона.
Литература
1. Jemal A., Center M.M., DeSantis C., Ward E.M. Global patterns of cancer incidence and mortality rate and trends // Cancer Epid. Biomar. Prev. 2010. Vol. 19, № 8. P. 1893–1907.
2. Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2010 году (заболеваемость и смертность). М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России, 2012. 260 с.
3. Buganim Y., Rotter V. p53: balancing tumour suppression and implications for the clinic // Eur. J. Cancer. 2009. Vol. 45. P. 217–234.
4. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory // Genes Dev. 2002. Vol. 16. Р. 6–21.
5. Prokhortchouk E., Hendrich B. Methyl-CpG binding proteins and cancer: are MeCpGs more important than MBDs // Oncogene. 2002. Vol. 21. P. 5394–5399.
6. Koutsimpelas D., Pongsapich W., Heinrich U. et al. Promoter methylation of MGMT, MLH1 and RASSF1A tumor suppressor genes in head and neck squamous cell carcinoma: pharmacological genome demethylation reduces proliferation of head and neck squamous carcinoma cells // Oncol. Rep. 2012. Vol. 27, № 4. Р. 1135–1141.
7. Hesson L.B., Cooper W.N., Latif F. The role of RASSF1A methylation in cancer // Dis Markers. 2007. Vol. 23. № 1–2. Р. 73–87.
8. Shivakumar L., Minna J.D., Sakamaki T. et al. 2002. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation // Mol. Cell. Biol. Vol. 22. P. 4309–4318.
9. Agathanggelou A., Cooper W.N., Latif F. Role of the Ras-association domain family 1 tumor suppressor gene in human cancers // Cancer Res. 2005. Vol. 65. № 9. Р. 3497–3508.
10. Dammann R., Schagdarsurengin U., Seidel C. et al. The tumor suppressor RASSF1A in human carcinogenesis: an update // Histol. Histopathol. 2005. Vol. 20. № 2. P. 645–663.
11. Sato A., Sunayama J., Matsuda K.I. MEK-ERK Signaling Dictates DNA-Repair Gene MGMT Expression and Temozolomide Resistance of Stem-Like Glioblastoma Cells via the MDM2-p53 //Axis STEM CELLS. 2011. Vol. 29. P. 1942–1951.
12. Abouzeid H.E., Kassem A.M., Abdel Wahab A.H. et al. Promoter hypermethylation of RASSF1A, MGMT, and HIC-1 genes in benign and malignant colorectal tumors // Tumour Biol. 2011. Vol. 32. № 5. Р. 845–852.
13. Li Z., Zhang H., Yang J. et al. Promoter hypermethylation of DNA damage response genes in hepatocellular carcinoma // Cell. Biol. Int. 2012. Vol. 36. № 5. P. 427–432.
14. Kulis M., Esteller M. DNA methylation and cancer // Adv. Genet. 2010. Vol. 70. P. 27–56.
15. Логинов В.И., Базов В.И., Ходырев Д.С. и др. Районы потенциальных генов-супрессоров эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников на хромосоме 3 человека //Генетика. 2008. Т. 44. С. 250–256.
16. Herman J.G., Graff J.R., Myohanen S. et al. Methylationspecific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. № 18. P. 9821–9826.
17. Береснева Е.В., Рыков С.В., Ходырев Д.С. и др. Профиль метилирования группы генов микроРНК при светлоклеточном почечноклеточном раке; связь с прогрессией рака // Генетика. 2013, Т. 49. № 3. C. 366–375.
18. Esteller M., Hamilton S.R., Burger P.C. et al. Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in primary human neoplasia // Cancer Res. 1999. Vol. 59. № 4. Р. 793–797.
19. Логинов В.И., Малюкова А.В., Серегин Ю.А. и др. Уровень метилирования гена RASSF1A в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и яичников // Молекуляр. биология. 2004. Т. 38. С. 654–66798, С. 7504–7509.
20. Jiang Y., Cui L., Chen W.D. et al. The prognostic role of RASSF1A promoter methylation in breast cancer: a meta-analysis of published data // PLoS One. 2012. Vol. 7. № 5. Р. 367–380.
21. Tserga A., Michalopoulos N.V., Levidou G. et al. Association of aberrant DNA methylation with clinicopathological features in breast cancer // Oncol. Rep. 2012. Vol. 27. № 5. Р. 1630–1638.
22. Sharma G., Mirza S., Parshad R. et al. Clinical significance of promoter hypermethylation of DNA repair genes in tumor and serum DNA in invasive ductal breast carcinoma patients // Life Sci. 2010. Vol. 87. № 3–4. Р. 83–91.
23. Kajabova V., Smolkova B., Zmetakova I. et al. RASSF1A Promoter Methylation Levels Positively Correlate with Estrogen Receptor Expression in Breast Cancer Patients // Transl. Oncol. 2013. Vol. 6. № 3. Р. 297–304.
24. Pfeifer G.P., Dammann R., Tommasi S. RASSF proteins // Curr. Biol. 2010. Vol. 20. № 8. R. 344–345.
25. Землякова В.В., Жевлова А.И., Зборовская И.Б. и др. Профиль метилирования некоторых генов-супрессоров опухолевого роста при немелкоклеточном раке легкого // Молекуляр. биология. 2003. Т. 37, № 6. С. 983–988.
26. Fackler M.J., McVeigh M., Evron E. et al. DNA methylation of RASSF1A, HIN-1, RAR-beta, Cyclin D2 and Twist in in situ and invasive lobular breast carcinoma // Int. J. Cancer. 2003. Vol. 107. № 6. Р. 970–975.
27. Muggerud A.A., Rønneberg J.A., Wärnberg F. et al. Frequent aberrant DNA methylation of ABCB1, FOXC1, PPP2R2B and PTEN in ductal carcinoma in situ and early invasive breast cancer // Breast Cancer Res. 2010. Vol. 12. № 1. R. 3.
28. Feng W., Shen L., Wen S. et al. Correlation between CpG methylation profiles and hormone receptor status in breast cancers // Breast Cancer Res. 2007. Vol. 9. R. 57.
29. Xu J., Shetty P.B., Feng W. et al. Methylation of HIN-1, RASSF1A, RIL and CDH13 in breast cancer is associated with clinical characteristics, but only RASSF1A methylation is associated with outcome // BMC Cancer. 2012. Vol. 12. Р. 243.
30. Karray-Chouayekh S., Trifa F., Khabir A. et al. Aberrant methylation of RASSF1A is associated with poor survival in Tunisian breast cancer patients // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2010. Vol.136. № 2. Р. 203–210.
