Возможности применения раман-флуоресцентной спектроскопии в оториноларингологии

По данным Министерства здравоохранения Российской Федерации за 2012 г., в структуре общей заболеваемости взрослого населения Центрального федерального округа (ЦФО) болезни органов дыхания занимают 2-е место (14,8%), уступая только болезням системы кровообращения (18,7%), а в структуре общей заболеваемости детского населения – 1-е место (50,1%), составляя половину от общей заболеваемости. В структуре первичной заболеваемости взрослого и детского населения ЦФО болезни органов дыхания занимают 1-е место, составляя 26,4 и 59,4% соответственно. Гнойно-воспалительные заболевания являются преобладающими в структуре ЛОР-патологий, составляя примерно 40% [11].

Микрофлора, колонизирующая нестерильные отделы верхних дыхательных путей, представлена в основном сапрофитными микроорганизмами, которые практически никогда не вызывают заболеваний у человека, а также условно-патогенными микроорганизмами, способными при неблагоприятных для макроорганизма условиях вызывать гнойный процесс. Как известно, основными возбудителями острых форм оториноларингологических инфекций являются Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae, довольно частыми – Moraxella catarrhalis, различные виды стафилококков, стрептококков и др. Условия труда различных профессиональных групп населения также являются фактором, способствующим возникновению острых и формированию хронических ЛОР-заболеваний, что существенно влияет на качество жизни, ее продолжительность, состояние трудоспособности [4]. Таким образом, в последние годы вопросы лечения и предупреждения ЛОР-заболеваний приобрели особую актуальность.

В настоящее время диагностика заболеваний ЛОР-органов перешла на принципиально новый уровень. Еще недавно для диагностики заболеваний оториноларингологами проводились осмотр пациента, рентгенография и простейшие лабораторные исследования. Сегодня в арсенале ЛОР-врача имеется широкий спектр дополнительных инструментальных и лабораторных методов исследования: эндоскопия, различные лабораторные исследования (в т. ч. методом полимеразной цепной реакции, позволяющим безошибочно определить вид возбудителя воспалительного процесса), аудиометрия, тимпанометрия и т. д. Однако все еще остается необходимость создания универсальных, отличающихся простотой выполнения и высокоскоростных методов диагностики, которые способствовали бы более раннему и эффективному началу лечения и улучшению прогноза того или иного заболевания. Эти методы должны быть достоверными, быстрыми и экономически оправданными.

Одним из наиболее перспективных направлений решения указанных проблем является использование лазерного излучения и лазерной медицинской техники. Именно лазерные и компьютеризированные автоматизированные системы считаются основным, приоритетным направлением развития медицинской техники последних лет [6].

Результатом развития технологий лазерной флуоресцентной диагностики является лазерная рамановская диагностика (ЛРД), достоинства которой находят практическое применение в различных областях: биофизике, фармакологии, микробиологии, химической промышленности, медицине. Изучение и развитие фотодинамической диагностики невозможно без знаний физико-химических принципов, лежащих в основе флуоресценции.

Явление флуоресценции было впервые исследовано Гершелем в 1845 г. на растворе сернокислого хинина. Подробно изучено данное явление было Стоксом (1852–1864 гг.), который и дал ему название флуоресценции, т. к. наблюдал его в фиолетовых и зеленых разновидностях дербиширского плавикового шпата (флюорита). Электронная спектроскопия связана с изучением энергетических переходов между различными электронными состояниями атомов и молекул. Электронные спектры многоатомных молекул исследуются обычно как спектры поглощения и спектры люминесценции. Спектры поглощения возникают в результате переходов из основного электронного состояния в возбужденные за счет поглощения квантов электромагнитного излучения, а спектры люминесценции – в результате перехода молекулы из возбужденного состояния в основное с испусканием электромагнитного излучения. Свечение вещества, возникающее при переходе молекул из возбужденного состояния в основное, называют люминесценцией [7].

Люминесценция подразделяется на 2 вида (флуоресценцию и фосфоресценцию) в зависимости от характера электронного состояния [10], из которого молекулы переходят в основное состояние с испусканием электромагнитного излучения, что проиллюстрировано на диаграмме Яблонского (рис. 1).

Способность многих веществ флуоресцировать, фосфоресцировать как в газовой, так и в твердой и жидкой фазах, служит основой для их количественного и качественного анализа. Флуоресцентная спектроскопия является одним из самых высокочувствительных методов, позволяющих детектировать очень низкие концентрации веществ (мкМ, нМ и даже пМ) и отличать одно вещество от другого [8]. Достоинством флуоресцентной спектроскопии является также отсутствие повреждения образца в ходе исследования, т. е. можно работать с нативными препаратами [5].

Вышеуказанные сведения о собственной флуоресценции органических соединений, встречающихся в живой клетке любого организма, послужили основой для разработки нового способа диагностики. Высокая эффективность метода лазерной флуоресцентной диагностики выявлена при индикации аэробной и анаэробной инфекции у детей и взрослых [1].

Диагностический потенциал флуоресценции биологических тканей был впервые описан H. Stubel в 1911 г. Ученый исследовал «родную флуоресценцию» (аутофлуоресценцию) тканей животных при освещении их ультрафиолетовым светом [16]. В 1924 г. французский ученый A. Policard наблюдал красную флуоресценцию порфиринов при исследовании ткани опухоли под лампой Вуда [12]. Спустя несколько лет немецкими исследователями H. Auler и G. Banzer впервые были описаны локализация и флуоресценция экзогенно вводимых в злокачественные опухоли порфиринов [14]. В некоторых исследованиях сообщалось об экзогенном применении HpD, порфиринов и предшественников порфирина для обнаружения опухолевых и неопухолевых поражений в различных органах. HpD – фотосенсибилизатор с улучшенными свойствами, производное гематопорфирина, обозначаемого в англоязычной литературе «HpD», т. к. сам гематопорфирин представляет собой смесь порфиринов и инертных примесей. Производное гематопорфирина в 2 раза токсичнее, чем первоначальный препарат, и обладает в 2 раза более высоким фотодинамическим действием. Впервые HpD было приготовлено S. Schwartz путем обработки гематопорфирина концентрированной серной и уксусной кислотами и применено в клинике Мейо (США) в 1960 г. для выявления опухолей [18].

В 1960-х и 1970-х гг. для оценки флуоресценции с использованием производных гематопорфирина проводились группы исследований по выявлению новообразований шейки матки [19, 21], пищевода, прямой кишки, бронхов [15, 20], а также в области органов головы и шеи (полости рта, глотки, гортани) [17]. Спектры поглощения и излучения эндогенных флуорохромов представлены на рисунке 2.

В наши дни методы раман-флуоресцентной спектроскопии нашли применение в приборах «ИнСпектр» – портативном рамановском комплексе, с помощью которого можно проводить экспресс-анализ органических и неорганических субстанций (заявка на патент РФ на полезную модель № 2011107305 от 28.02.2011 г.). В течение нескольких секунд проводятся запись спектра исследуемого объекта, определение спектрального положения и относительных интенсивностей рамановских и люминесцентных линий – своего рода «отпечатков пальцев» исследуемой субстанции, поиск и сравнение этих «отпечатков» со спектральной базой данных известных объектов. Для экспресс-анализа не требуется предварительной подготовки или обработки исследуемых объектов («Разработка ЛРД аппаратно-программных комплексов и их модификаций») [1]. Схематически раман-флуоресцентный комплекс «ИнСпектр» изображен на рисунке 3.

Данная методика нашла свое применение в стоматологии, гинекологии и других областях медицины. Так, проводилось исследование in vitro на свежеудаленных по клиническим показаниям зубах. В ходе научной работы было доказано, что применение рамановского рассеяния позволяет определять относительную величину минерализации твердых тканей зуба, эффективность реминерализирующей терапии, проводить дифференциальную диагностику поражений твердых тканей зуба, качественно и количественно диагностировать ведущий этиологический (микробный) фактор развития кариеса зубов, индивидуально выбирать эффективный антисептический дезинфектант [3].

Возможности применения рамановского рассеяния в гинекологической практике показаны в работе по исследованию спектральных характеристик органов малого таза у женщин, в ходе которой путем анализа рамановского излучения и люминесценции был выявлен ряд особенностей, отличающих ткань опухоли от нормальной ткани [2].

Метод гигантского рамановского рассеяния на подложках с металлическими наношариками серебра стал применяться при экспресс-индикации микроорганизмов: позволял определить их видовую принадлежность, чувствительность к антимикробным препаратам (ускоренное определение), увидеть сигнал от одиночной бактерии при облучении ее лазерным светом [3].

Возможности ЛРД, позволяющие определить микробный пейзаж, особенности гистологического строения тканей, степень выраженности воспалительной реакции, могут быть с успехом применены в лечении и диагностике широкого спектра ЛОР-заболеваний. Одной из наиболее распространенных патологий среди болезней уха, горла и носа является хронический тонзиллит (ХТ).

Небные миндалины выполняют важные функции в иммунной системе человеческого организма. ХТ занимает лидирующую позицию в структуре ЛОР-патологии. Следует отметить, что ХТ, являясь постоянным очагом инфекции в организме, влияет на различные его функции. Социальная значимость данной патологии подчеркивается тем, что обострения ХТ являются частой причиной временной нетрудоспособности, а в случае развития осложнений могут приводить к инвалидизации и даже смерти пациентов.

Инфекция в небных миндалинах часто является пусковым механизмом для патологических изменений сердечно-сосудистой системы, почек, соединительной ткани, эндокринных органов [9]. Таким образом, проблема ХТ затрагивает не только оториноларингологию, но и другие области медицины.

Зачастую имеющейся клинической диагностики ХТ недостаточно. Это заставляет прибегать к дополнительным методам обследования пациентов, а трудности диагностики обусловливают необходимость использования дополнительных лабораторных методов.

ЛРД является перспективным методом, позволяющим оценить выраженность воспалительных процессов, а также их точную микробиологическую характеристику (если таковая имеется). Однако для проведения сравнительного анализа необходимо выявить закономерности и особенности спектров интактных тканей ЛОР-органов, а именно глотки и миндалин, оценить микробиологический пейзаж тканей миндалины, что и явилось целью нашей работы.

В ходе клинического исследования на базе кафедры болезней уха, горла и носа Первого МГМУ им. И.М. Сеченова проводится изучение спектральных характеристик интактных тканей ЛОР-органов – небных миндали и задней стенки глотки. В исследовании приняли участие 50 человек в возрасте 16–59 лет.

В результате исследования создана база спектральных характеристик интактных тканей задней стенки глотки и миндалин, которая позволит определить возможности использования аппаратно-программного комплекса «ИнСпектр» для экспресс-диагностики ХТ, а также динамического мониторинга эффективности лечения.