Возможности применения раман-флуоресцентной спектроскопии в оториноларингологии
Журнал входит в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК.
Для цитирования: Свистушкин В.М., Александров М.Т., Пшонкина Д.М., Шевчик Е.А. Возможности применения раман-флуоресцентной спектроскопии в оториноларингологии // РМЖ. 2015. №6. С. 317
Распространенность заболеваний ЛОР-органов, по данным мировой и отечественной статистики, постоянно растет, что обусловлено как антропогенным загрязнением окружающей среды, оказывающим выраженное воздействие на формирование популяционного здоровья, так и появлением антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, а также усилением роли условно-патогенной флоры (энтеробактерии, синегнойная палочка, внутриклеточные возбудители).
По данным Министерства здравоохранения Российской Федерации за 2012 г., в структуре общей заболеваемости взрослого населения Центрального федерального округа (ЦФО) болезни органов дыхания занимают 2-е место (14,8%), уступая только болезням системы кровообращения (18,7%), а в структуре общей заболеваемости детского населения – 1-е место (50,1%), составляя половину от общей заболеваемости. В структуре первичной заболеваемости взрослого и детского населения ЦФО болезни органов дыхания занимают 1-е место, составляя 26,4 и 59,4% соответственно. Гнойно-воспалительные заболевания являются преобладающими в структуре ЛОР-патологий, составляя примерно 40% [11].
Микрофлора, колонизирующая нестерильные отделы верхних дыхательных путей, представлена в основном сапрофитными микроорганизмами, которые практически никогда не вызывают заболеваний у человека, а также условно-патогенными микроорганизмами, способными при неблагоприятных для макроорганизма условиях вызывать гнойный процесс. Как известно, основными возбудителями острых форм оториноларингологических инфекций являются Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae, довольно частыми – Moraxella catarrhalis, различные виды стафилококков, стрептококков и др. Условия труда различных профессиональных групп населения также являются фактором, способствующим возникновению острых и формированию хронических ЛОР-заболеваний, что существенно влияет на качество жизни, ее продолжительность, состояние трудоспособности [4]. Таким образом, в последние годы вопросы лечения и предупреждения ЛОР-заболеваний приобрели особую актуальность.
В настоящее время диагностика заболеваний ЛОР-органов перешла на принципиально новый уровень. Еще недавно для диагностики заболеваний оториноларингологами проводились осмотр пациента, рентгенография и простейшие лабораторные исследования. Сегодня в арсенале ЛОР-врача имеется широкий спектр дополнительных инструментальных и лабораторных методов исследования: эндоскопия, различные лабораторные исследования (в т. ч. методом полимеразной цепной реакции, позволяющим безошибочно определить вид возбудителя воспалительного процесса), аудиометрия, тимпанометрия и т. д. Однако все еще остается необходимость создания универсальных, отличающихся простотой выполнения и высокоскоростных методов диагностики, которые способствовали бы более раннему и эффективному началу лечения и улучшению прогноза того или иного заболевания. Эти методы должны быть достоверными, быстрыми и экономически оправданными.
Одним из наиболее перспективных направлений решения указанных проблем является использование лазерного излучения и лазерной медицинской техники. Именно лазерные и компьютеризированные автоматизированные системы считаются основным, приоритетным направлением развития медицинской техники последних лет [6].
Результатом развития технологий лазерной флуоресцентной диагностики является лазерная рамановская диагностика (ЛРД), достоинства которой находят практическое применение в различных областях: биофизике, фармакологии, микробиологии, химической промышленности, медицине. Изучение и развитие фотодинамической диагностики невозможно без знаний физико-химических принципов, лежащих в основе флуоресценции.
Явление флуоресценции было впервые исследовано Гершелем в 1845 г. на растворе сернокислого хинина. Подробно изучено данное явление было Стоксом (1852–1864 гг.), который и дал ему название флуоресценции, т. к. наблюдал его в фиолетовых и зеленых разновидностях дербиширского плавикового шпата (флюорита). Электронная спектроскопия связана с изучением энергетических переходов между различными электронными состояниями атомов и молекул. Электронные спектры многоатомных молекул исследуются обычно как спектры поглощения и спектры люминесценции. Спектры поглощения возникают в результате переходов из основного электронного состояния в возбужденные за счет поглощения квантов электромагнитного излучения, а спектры люминесценции – в результате перехода молекулы из возбужденного состояния в основное с испусканием электромагнитного излучения. Свечение вещества, возникающее при переходе молекул из возбужденного состояния в основное, называют люминесценцией [7].
Люминесценция подразделяется на 2 вида (флуоресценцию и фосфоресценцию) в зависимости от характера электронного состояния [10], из которого молекулы переходят в основное состояние с испусканием электромагнитного излучения, что проиллюстрировано на диаграмме Яблонского (рис. 1).
Способность многих веществ флуоресцировать, фосфоресцировать как в газовой, так и в твердой и жидкой фазах, служит основой для их количественного и качественного анализа. Флуоресцентная спектроскопия является одним из самых высокочувствительных методов, позволяющих детектировать очень низкие концентрации веществ (мкМ, нМ и даже пМ) и отличать одно вещество от другого [8]. Достоинством флуоресцентной спектроскопии является также отсутствие повреждения образца в ходе исследования, т. е. можно работать с нативными препаратами [5].
Вышеуказанные сведения о собственной флуоресценции органических соединений, встречающихся в живой клетке любого организма, послужили основой для разработки нового способа диагностики. Высокая эффективность метода лазерной флуоресцентной диагностики выявлена при индикации аэробной и анаэробной инфекции у детей и взрослых [1].
Диагностический потенциал флуоресценции биологических тканей был впервые описан H. Stubel в 1911 г. Ученый исследовал «родную флуоресценцию» (аутофлуоресценцию) тканей животных при освещении их ультрафиолетовым светом [16]. В 1924 г. французский ученый A. Policard наблюдал красную флуоресценцию порфиринов при исследовании ткани опухоли под лампой Вуда [12]. Спустя несколько лет немецкими исследователями H. Auler и G. Banzer впервые были описаны локализация и флуоресценция экзогенно вводимых в злокачественные опухоли порфиринов [14]. В некоторых исследованиях сообщалось об экзогенном применении HpD, порфиринов и предшественников порфирина для обнаружения опухолевых и неопухолевых поражений в различных органах. HpD – фотосенсибилизатор с улучшенными свойствами, производное гематопорфирина, обозначаемого в англоязычной литературе «HpD», т. к. сам гематопорфирин представляет собой смесь порфиринов и инертных примесей. Производное гематопорфирина в 2 раза токсичнее, чем первоначальный препарат, и обладает в 2 раза более высоким фотодинамическим действием. Впервые HpD было приготовлено S. Schwartz путем обработки гематопорфирина концентрированной серной и уксусной кислотами и применено в клинике Мейо (США) в 1960 г. для выявления опухолей [18].

В 1960-х и 1970-х гг. для оценки флуоресценции с использованием производных гематопорфирина проводились группы исследований по выявлению новообразований шейки матки [19, 21], пищевода, прямой кишки, бронхов [15, 20], а также в области органов головы и шеи (полости рта, глотки, гортани) [17]. Спектры поглощения и излучения эндогенных флуорохромов представлены на рисунке 2.
В наши дни методы раман-флуоресцентной спектроскопии нашли применение в приборах «ИнСпектр» – портативном рамановском комплексе, с помощью которого можно проводить экспресс-анализ органических и неорганических субстанций (заявка на патент РФ на полезную модель № 2011107305 от 28.02.2011 г.). В течение нескольких секунд проводятся запись спектра исследуемого объекта, определение спектрального положения и относительных интенсивностей рамановских и люминесцентных линий – своего рода «отпечатков пальцев» исследуемой субстанции, поиск и сравнение этих «отпечатков» со спектральной базой данных известных объектов. Для экспресс-анализа не требуется предварительной подготовки или обработки исследуемых объектов («Разработка ЛРД аппаратно-программных комплексов и их модификаций») [1]. Схематически раман-флуоресцентный комплекс «ИнСпектр» изображен на рисунке 3.
Данная методика нашла свое применение в стоматологии, гинекологии и других областях медицины. Так, проводилось исследование in vitro на свежеудаленных по клиническим показаниям зубах. В ходе научной работы было доказано, что применение рамановского рассеяния позволяет определять относительную величину минерализации твердых тканей зуба, эффективность реминерализирующей терапии, проводить дифференциальную диагностику поражений твердых тканей зуба, качественно и количественно диагностировать ведущий этиологический (микробный) фактор развития кариеса зубов, индивидуально выбирать эффективный антисептический дезинфектант [3].

Возможности применения рамановского рассеяния в гинекологической практике показаны в работе по исследованию спектральных характеристик органов малого таза у женщин, в ходе которой путем анализа рамановского излучения и люминесценции был выявлен ряд особенностей, отличающих ткань опухоли от нормальной ткани [2].
Метод гигантского рамановского рассеяния на подложках с металлическими наношариками серебра стал применяться при экспресс-индикации микроорганизмов: позволял определить их видовую принадлежность, чувствительность к антимикробным препаратам (ускоренное определение), увидеть сигнал от одиночной бактерии при облучении ее лазерным светом [3].
Возможности ЛРД, позволяющие определить микробный пейзаж, особенности гистологического строения тканей, степень выраженности воспалительной реакции, могут быть с успехом применены в лечении и диагностике широкого спектра ЛОР-заболеваний. Одной из наиболее распространенных патологий среди болезней уха, горла и носа является хронический тонзиллит (ХТ).
Небные миндалины выполняют важные функции в иммунной системе человеческого организма. ХТ занимает лидирующую позицию в структуре ЛОР-патологии. Следует отметить, что ХТ, являясь постоянным очагом инфекции в организме, влияет на различные его функции. Социальная значимость данной патологии подчеркивается тем, что обострения ХТ являются частой причиной временной нетрудоспособности, а в случае развития осложнений могут приводить к инвалидизации и даже смерти пациентов.
Инфекция в небных миндалинах часто является пусковым механизмом для патологических изменений сердечно-сосудистой системы, почек, соединительной ткани, эндокринных органов [9]. Таким образом, проблема ХТ затрагивает не только оториноларингологию, но и другие области медицины.

Зачастую имеющейся клинической диагностики ХТ недостаточно. Это заставляет прибегать к дополнительным методам обследования пациентов, а трудности диагностики обусловливают необходимость использования дополнительных лабораторных методов.
ЛРД является перспективным методом, позволяющим оценить выраженность воспалительных процессов, а также их точную микробиологическую характеристику (если таковая имеется). Однако для проведения сравнительного анализа необходимо выявить закономерности и особенности спектров интактных тканей ЛОР-органов, а именно глотки и миндалин, оценить микробиологический пейзаж тканей миндалины, что и явилось целью нашей работы.
В ходе клинического исследования на базе кафедры болезней уха, горла и носа Первого МГМУ им. И.М. Сеченова проводится изучение спектральных характеристик интактных тканей ЛОР-органов – небных миндали и задней стенки глотки. В исследовании приняли участие 50 человек в возрасте 16–59 лет.
В результате исследования создана база спектральных характеристик интактных тканей задней стенки глотки и миндалин, которая позволит определить возможности использования аппаратно-программного комплекса «ИнСпектр» для экспресс-диагностики ХТ, а также динамического мониторинга эффективности лечения.
- Александров М.Т., Таубинский И.М., Козьма С.Ю. Способ для обнаружения и оценки концентраций анаэробных бактерий в биологическом субстрате (Патент РФ № 97100364 от 21.01.1997).
- Александров М.Т., Зуев В.М., Кукушкин В.В. и соавт. Исследование спектральных характеристик органов малого таза у женщин и их клиническое значение // Онкогинекология. 2013. № 3. С. 61–67.
- Александров М.Т., Зубов С.В., Березинская А.С. и соавт. Экспериментально-теоретическое обоснование принципов и особенностей применения метода лазерно-конверсионной диагностики для оценки состояния твердых тканей зуба в норме и при патологии (кариес) // Российский стоматологический журнал. 2013. № 4. С. 6–10.
- Вахабов А.А., Хидиров Б.Х., Гариб М.Ю. Изучение состояния ЛОР-органов у работников промышленных предприятий г. Самарканда и области: Мат-лы научн. конф. проф.-препод. состава СамМИ. Ташкент, 1980. С. 150.
- Векшин Н.Л. Флюоресцентная спектроскопия биополимеров. Пущино: Фотон-век, 2006. 168 с.
- Евстигнеев А.Р. Лазерные фотометры для экспериментально-клинической медицины // Электронная промышленность. 1987. № 1.
- Левшин Л.В., Салецкий А.М. Оптические методы исследования молекулярных систем. Ч. 1. Молекулярная спектроскопия. М.: Изд-во МГУ, 1994.
- Медицинская технология «Применение экспресс-метода лазерной флуоресценции для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» от 07.08.2007 (№ ФС-2007/158).
- Овчинников А.Ю., Славский А.Н., Фетисов И.С. Хронический тонзиллит и сопряженные с ним заболевания // РМЖ. 1999. Т. 7. № 7.
- Пентин Ю.А., Вилков Л.В. Физические методы исследования в химии. М.: Мир, 2003.
- Соусова Е.В. Эпидемиология гнойно-септических инфекций ЛОР-органов в условиях амбулаторно-поликлинических учреждений: Автореф. дисс... канд. мед. наук. СПб., 1997. 14 с.
- Policard А. Etudes sur les aspects offerts par des tumeurs experimentales examines a la lumiere de Wood // CR Soc Biol. 1924. Vol. 91. Р. 1423–1424.
- Wagnieres G.A., Star W.M., Wilson B.C. In vivo fluorescence spectroscopy and imaging for oncological applications // Photochem Photobiol. 1998. Vol. 68. P. 603–632.
- Auler Н., Banzer G. Untersuchungen uber die Rolle der Porphyrine bei geschwulstkranken Menschen und Tieren // Z Krebsforschung. 1942. Vol. 53. Р. 65–68.
- Gregorie H.B., Horger Jr.E.O., Ward J.L., Green J.F., T. Richards, Robertson H.C., Stevenson Jr. and T.B. Hematoporphyrin-derivative fluorescence in malignant neoplasms // Ann Surg. 1968. Vol. 167 (6). Р. 820–828.
- Stubel Н. Die Fluoreszenz tierischer Gewebe in ultraviolettem Licht // Pflugers Arch Physiol. 1911. Vol. 142 (1). Р. 1–14.
- Leonard J.R., Beck W.L. Hematoporphyrin fluorescence: an aid in diagnosis of malignant neoplasms // Laryngoscope. 1971. Vol. 81 (3). Р. 365–372.
- Lipson R.L., Baldes E.J., Olsen A.M. The use of a derivative of hematoporphyrin in tumor detection // J Natl Cancer Inst. 1961. Vol. 26. Р. 1–8.
- Gray M.J., Lipson R. Maeck J. V., Parker L. Romeyn D. Use of hematoporphyrin derivative in detection and management of cervical cancer // Am J Obstet Gynecol. 1967. Vol. 99 (6). Р. 766–771.
- Lipson R. L., Baldes E.J., Gray M.J. Hematoporphyrin derivative for detection and management of cancer // Cancer. 1967. Vol. 20 (12). Р. 2255–2257.
- Lipson R. L., Pratt J.H., Baldes E.J., Dockerty M.B. Hematoporphyrine Derivative for Detection of Cervical Cancer // Obstet Gynecol. 1964. Vol. 24. Р. 78–84.
Поделитесь статьей в социальных сетях
Авторизируйтесь или зарегистрируйтесь на сайте для того чтобы оставить комментарий.
зарегистрироваться авторизоваться