Оценка механизмов устойчивости к антимикробным препаратам клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa

лет

предоставляем актуальную медицинскую информацию от ведущих специалистов, помогая врачам в ежедневной работе

Присоединяйтесь!

Личный кабинет

лет

Присоединяйтесь!

лет

Присоединяйтесь!

Оценка механизмов устойчивости к антимикробным препаратам клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa

string(5) "77347"

Клиническая фармакология

797

19 декабря 2023

ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород

Введение: представители вида Pseudomonas aeruginosa, обладающие устойчивостью к карбапенемам, представляют серьезную проблему в области инфекционной патологии человека.

Цель исследования: оценка генетических механизмов резистентности к антибактериальным препаратам клинических штаммов P. aeruginosa.

Материал и методы: исследование включало полногеномное секвенирование на платформе MiSeq (Illumina) шести клинических штаммов P. aeruginosa, характеризующихся устойчивостью к карбапенемам. Проведен биоинформатический анализ полученных результатов секвенирования с использованием специализированных веб-сервисов и баз данных.

Результаты и обсуждение: согласно результатам биоинформатического анализа установлено, что штаммы принадлежат к эпидемически значимым, глобально распространенным сиквенс-типам 235 (n=3), 357 (n=2) и 654 (n=1). В структуре генома всех исследуемых штаммов P. aeruginosa присутствуют гены сериновых β-лактамаз PDC (молекулярный класс С) и OXA-50-подобных (молекулярный класс D), а также гены aph(3’)-IIb, fosA, catB7. Штаммы сиквенс-типа 357 дополнительно обладают генами β-лактамазы расширенного спектра группы VEB. Впервые описан случай обнаружения blaVEB-14 у представителя сиквенс-типа 357. Детерминанта металло-β-лактамазы VIM-2 была определена только у штамма сиквенс-типа 654. У двух штаммов сиквенс-типа 235 выявлен In998-подобный интегрон, несущий ген β-лактамазы расширенного спектра blaOXA-14. У всех исследуемых штаммов определено наличие мутаций в гене nalC, приводящих к увеличению скорости выведения антибактериальных препаратов за счет гиперэкспрессии эффлюксных белков MexAB-OprM, и мутаций в гене поринового белка OprD, связанных со снижением проницаемости для карбапенемов. Сочетание этих двух механизмов, по-видимому, обусловливает формирование резистентности к карбапенемам у штаммов P. aeruginosa, не обладающих карбапенемазной активностью.

Заключение: в исследовании показана популяционная структура клинических, устойчивых к карбапенемам штаммов P. aeruginosa. Установлено, что основным механизмом карбапенеморезистентности является мутационная изменчивость хромосомных генов. Полученные данные свидетельствуют о необходимости рационального использования антибактериальных препаратов с целью предотвращения распространения антибиотикорезистентных патогенов.

Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, сиквенс-тип, механизмы резистентности, мутации, blaVEB-14, blaOXA-14.

Assessment of the antimicrobial resistance mechanisms of Pseudomonas aeruginosa clinical strains

A.E. Alekseeva, N.F. Brusnigina, M.A. Makhova

Academician I.N. Blokhina Nizhniy Novgorod Research Institute for Epidemiology and Microbiology, Nizhniy Novgorod

Background: Pseudomonas aeruginosa resistance to carbapenems is a major challenge in the field of human infectious diseases.

Aim: to assess the genetic mechanisms of antibacterial resistance of clinical strains of P. aeruginosa.

Materials and Methods: the study included whole-genome sequencing (MiSeq, Illumina) of six clinical strains of P. aeruginosa resistant to carbapenems. Bioinformatics analysis of sequencing results was performed using specialized web services and databases.

Results and Discussion: bioinformatics analysis has demonstrated that strains belong to epidemically significant, globally widespread sequence types 235 (n=3), 357 (n=2), and 654 (n=1). The genome structure of all studied P. aeruginosa strains contains serine β-lactamase PDC (molecular class C) and OXA-50-like (molecular class D) genes as well as aph(3’)-IIb, fosA, and catB7 genes. In addition, sequence-type 357 strains include extended-spectrum β-lactamase VEB genes. BlaVEB-14 has been described in sequence-type 357 for the first time. The VIM-2 metallo-β-lactamase determinant was identified only in sequence-type strain 654. In two sequence-type 235 strains, an In998-like integron carrying the extended-spectrum β-lactamase gene blaOXA-14 was identified. In all studied strains, mutations in the nalC gene were detected. These mutations increase the rate of elimination of antibacterial drugs due to the overexpression of the efflux proteins MexAB-OprM. Meanwhile, mutations in the porin protein gene OprD are associated with a decrease in carbapenem permeability. The combination of these two mechanisms may mediate carbapenem resistance of P. aeruginosa strains without carbapenemase activity.

Conclusion: our study describes the population structure of clinical carbapenem-resistant P. aeruginosa strains. The key mechanism of carbapenem resistance is mutational variability in chromosomal genes. These findings illustrate the need for the rational use of antibacterial drugs to prevent antibiotic-resistant pathogen spread.

Keywords: Pseudomonas aeruginosa, sequence type, mechanisms of resistance, mutations, blaVEB-14, blaOXA-14.

For citation: Alekseeva A.E., Brusnigina N.F., Makhova M.A. Assessment of the antimicrobial resistance mechanisms of Pseudomonas aeruginosa clinical strains. RMJ. 2023;10:48-51.

Для цитирования: Алексеева А.Е., Бруснигина Н.Ф., Махова М.А. Оценка механизмов устойчивости к антимикробным препаратам клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa. РМЖ. 2023;10:48-51.

Введение

Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa являются опасными оппортунистическими патогенами — актуальными возбудителями инфекций, связанными с оказанием медицинской помощи, что обусловливает повышенное внимание к их изучению со стороны научного сообщества [1–5]. Так, по данным российского эпидемиологического многоцентрового исследования «МАРАФОН», в 17,4% случаев возбудителями госпитальных инфекций являются штаммы P. aeruginosa [3]. Согласно сведениям, представленным на онлайн-платформе AMRmap, созданной для анализа данных о резистентности бактерий к антимикробным препаратам в России [5], по состоянию на 2020 г. штаммы P. aeruginosa являются возбудителями нозокомиальных инфекций в 18,6% случаев.

Известно, что штаммы P. aeruginosa часто выявляются при сепсисе (20%), вентилятор-ассоциированных пневмониях (45%), инфекциях мочевыводящих путей (10%), интраабдоминальных инфекциях (28%), ожоговых и раневых инфекциях (17%), хронических респираторных инфекциях у пациентов с муковисцидозом (70%) [1–4]. Особую настороженность вызывают случаи инфекций кровотока и центральной нервной системы, вызванных полирезистентными штаммами P. aeruginosa, в связи с высокими показателями смертности (до 28%) и затратами на лечение [6, 7].

В формировании эпидемически значимых клонов P. аeruginosa большое значение имеют такие свойства возбудителя, как высокий адаптивный потенциал, пластичность генома, наличие широкого спектра детерминант патогенности и природной устойчивости к антибактериальным препаратам различных классов: цефалоспоринам, аминогликозидам, фторхинолонам [1, 2, 4]. Последнее обусловливает применение карбапенемов в качестве основного средства антибиотикотерапии инфекций, вызванных синегнойной палочкой.

В последние годы наблюдается рост числа штаммов P. aeruginosa с множественной и экстремальной лекарственной устойчивостью, что связано с накоплением мутаций в хромосомных генах, а также распространением генов металло-β-лактамаз (МБЛ) и β-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), локализованных на мобильных элементах [1–4]. По данным разных авторов, устойчивостью к карбапенемам обладали 13,87% штаммов P. aeruginosa, выделенных из мокроты [8], 50% нозокомиальных штаммов [4, 9] и до 70% штаммов из крови и ликвора [6, 7]. Это свидетельствует о необходимости динамического мониторинга за механизмами устойчивости бактерий данного вида с целью обеспечения эффективной терапии противомикробными препаратами.

С целью эпидмаркирования клинических штаммов P. aeruginosa используется схема молекулярного сиквенс-типирования (Multilocus Sequence Typing — MLST), основанная на анализе нуклеотидной последовательности генов «домашнего хозяйства» (acsA, aroE, guaA, mutL, nuoD, ppsA и trpE). С помощью данной схемы были определены доминирующие сиквенс-типы, которые сформировали группу международных «клонов высокого риска», к ним относятся сиквенс-типы 111, 175, 233, 235, 277, 357, 654 и 773 [1, 2, 4]. Отличительной особенностью данных сиквенс-типов является присутствие в геноме приобретенных генов БЛРС и карбапенемаз, включая МБЛ [1–4, 6–10].

В клинической практике для определения генов карбапенемаз используются коммерческие ПЦР тест-системы (например, «АмплиСенс^® MDR MBL-FL»), градиентные тест-полоски (Etests MBL IP/IPI, BioMerieux, Франция) и др. Однако данные методы не позволяют в полной мере оценить весь спектр генетических механизмов, вовлеченных в формирование устойчивости к антимикробным препаратам.

Применение современных технологий высокопроизводительного секвенирования и биоинформатического анализа позволяет проводить расширенное эпидмаркирование карбапенем-резистентных штаммов P. aeruginosa, имеющее большое значение для эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи.

Цель исследования — оценка механизмов устойчивости к антимикробным препаратам клинических штаммов P. aeruginosa.

Материал и методы

Объектом исследования являлись 6 клинических штаммов P. aeruginosa, выделенных из раневого отделяемого у пациентов с ожоговой травмой, находящихся на стационарном лечении в медицинских организациях г. Нижнего Новгорода. Все штаммы характеризовались устойчивостью к карбапенемам (имипенему, дорипенему, меропенему). Полногеномное секвенирование проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) с набором MiSeq Reagent kit v3 (150 циклов). Выравнивание и cборку нуклеотидных последовательностей de novo осуществляли с помощью программы SPAdes, версия 3.9.1. Аннотирование проводили с использованием Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok). Для определения сиквенс-типа штаммов P. aeruginosa по схеме Multilocus Sequence Typing (MLST) использовали поисковый сервис базы данных Pseudomonas aeruginosa typing database (https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_paeruginosa_seqdef). С помощью веб-сервиса Resistance Gene Identifier — RGI (https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi) базы данных The Comprehensive Antibiotic Resistance Database — CARD (https://card.mcmaster.ca/home) проводили определение генетических детерминант резистентности. Поиск гомологичных последовательностей, депонированных в базе данных GenBank, осуществляли с использованием сервиса BLASTN (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Web-сервисы ICEfinder (https://bioinfo-mml.sjtu.edu.cn/ICEfinder/index.php), IS-finder (https://www-is.biotoul.fr/), VRprofile2 (https://tool2-mml.sjtu.edu.cn/VRprofile/home.php) использовали для поиска и характеристики мобильных элементов.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования позволили определить детерминанты резистентности (см. таблицу).

Таблица. Механизмы резистентности штаммов P. aeruginosa

Согласно результатам типирования по схеме MLST установлено, что все исследуемые штаммы псевдомонад принадлежат к эпидемически значимым сиквенс-типам, имеющим глобальное распространение, представители сиквенс-типа 235 занимают лидирующие позиции по всему миру [10]. Штаммы P. aeruginosa, принадлежащие ST357, являются наиболее распространенными в Азии [10], а штаммы сиквенс-типа 654 имеют более широкое распространение на территории России (их доля достигает 24%) [11] по сравнению со странами Европы [10].

Сравнительный анализ структуры резистома показал, что общими для всех исследуемых штаммов P. aeruginosa являются гены β-лактамаз молекулярного класса С (PDC) и класса D (OXA-50-подобные), а также гены хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (catB7), фосфомицин-тиол-трансферазы (fosA), аминогликозид-фосфотрансферазы (aph(3’)-IIb).

С помощью сервиса VRprofile2 и IS-finder у исследуемых штаммов P. aeruginosa определены приобретенные детерминанты резистентности, которые связаны с мобильными структурами. В частности, у штаммов P. aeruginosa NNPs269 и NNPa50 гены clmA, acc(6’)-Ib (aacA4) и blaOXA-14 расположены в составе In998-подобного интегрона первого класса, отличие заключается в замене гена blaOXA-10 на blaOXA-14. БЛРС OXA-14 имеет аминокислотную замену G157D по сравнению с OXA-10, что обеспечивает ферментативную активность в отношении цефтазидима [12]. В результате поиска в базе данных GenBank идентичных последовательностей интегрона, несущих blaOXA-14, выявлено не было. Первый случай обнаружения (в Турции) штамма P. aeruginosa, продуцирующего β-лактамазу OXA-14, датируется 1991 г. [12]. У штамма P. aeruginosa NNPs269 определен ген аминогликозидаденилтрансферазы (aadA6) с последовательностью gcuD (orfD), кодирующей гипотетический белок. Штамм NNPs180 обладает In274-подобным интегроном (DQ899759.1), несущим гены aac(3’)-Ic и cmlA5, и дополнительную детерминанту smr, кодирующего белок семейства эффлюксных белков SMR. Также в структуре генома штамма NNPs180 определены кассетные гены aac(3)-Id-dfrB5-aac(6’)-Il. По данным литературы, у представителей сиквенс-типа 235 часто обнаруживается сходный по структуре интегрон 1-го типа — In559 (AM749810).

Ген МБЛ VIM-2 выявлен лишь у штамма P. aeruginosa NNPs244. Нужно отметить, что в геноме штамма NNPs244 присутствуют другие гены резистентности, которые сцеплены с мобильными элементами, в частности гены аминогликозидфосфотрансфераз (aph(6)-Id, aph(3’’)-Ib).

У штаммов NNPa51 и NNPa52 в структуре интегрона первого класса определены гены aac(6’)-I1, ant(2’’)-Ia, blaOXA-10, ant(3’’)-Ia. Различие между штаммами P. aeruginosa NNPa51 и NNPa52 наблюдается и в наличии генов, кодирующих аллельные варианты БЛРС — VEB, в частности VEB-14 и VEB-9 соответственно. Данные литературы свидетельствуют о широком распространении генов β-лактамазы VEB среди представителей сиквенс-типа 357, в первую очередь VEB-9 [13]. Факты обнаружения blaVEB-14 у представителей данного сиквенс-типа на настоящий момент в литературе не описаны.

Все исследуемые штаммы псевдомонад характеризуются наличием широкого разнообразия детерминант эффлюкс-систем, принадлежащих различным семействам (см. таблицу).

В ходе анализа нуклеотидной последовательности исследуемых штаммов были установлены изменения в структуре хромосомных генов, которые ассоциированы с формированием лекарственной устойчивости. В частности, у всех штаммов обнаружены мутации в структуре гена gyrA, сопровождающиеся аминокислотной заменой (T83I), что обусловливает снижение чувствительности к фторхинолонам, и в регуляторном гене nalC, приводящие к аминокислотным заменам (S209R, G71E). У штаммов псевдомонад сиквенс-типа ST235 выявлена дополнительная мутация в гене nalC, приводящая к замене E153Q. Известно, что данные мутации в гене nalC сопровождаются гиперэкспрессией эффлюксных белков MexAB-OprM, что увеличивает скорость выведения антибактериальных препаратов, включая карбапенемы, из клеток бактерий [14]. У 5 штаммов P. aeruginosa (кроме NNPa50) выявлена мутационная изменчивость нуклеотидной последовательности гена поринового белка OprD. Известно, что белок OprD ответственен за проницаемость имипенема внутрь бактериальной клетки [11]. По-видимому, комбинирование механизмов резистентности, обусловленных мутационными процессами в генах oprD и nalC, является ключевым фактором формирования устойчивости к карбапенемам исследуемых штаммов P. aeruginosa, не обладающих карбапенемазной активностью.

Заключение

Установлено, что исследуемые карбапенем-резистентные штаммы P. aeruginosa принадлежат к международным эпидемически значимым клональным линиям и характеризуются присутствием большого разнообразия детерминант резистентности к аминогликозидам и β-лактамам. Отмечены различия в наборе генов устойчивости между штаммами P. aeruginosa, принадлежащими к одному сиквенс-типу. Ген карбапенемазы VIM-2 определен только у представителя сиквенс-типа 654, остальные штаммы характеризовались присутствием генов БЛРС групп VEB-1 и OXA-10. Анализ структуры хромосомных генов показал, что устойчивость к карбапенемам штаммов P. aeruginosa, не обладающих карбапенемазной активностью, связана с комбинированием механизмов устойчивости, связанных с мутациями в структуре генов поринового OprD- и регуляторного NalC-белков.

Таким образом, получены новые знания о механизмах устойчивости клинических штаммов P. aeruginosa, принадлежащих к международным клонам «высокого риска», к антимикробным препаратам, включая карбапенемы. Применение высокопроизводительного секвенирования позволило получить детальную характеристику популяционной структуры карбапенем-устойчивых штаммов P. aeruginosa. Данная технология может стать одним из надежных методов молекулярной эпидемиологии в аспекте эпидемиологического маркирования возбудителей нозокомиальных инфекций. Источник финансирования

Работа выполнена в рамках государственного задания отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора на 2021–2025 гг. «Научное обеспечение эпидемиологического надзора и санитарной охраны территории Российской Федерации. Создание новых технологий, средств и методов контроля и профилактики инфекционных и паразитарных болезней» (п. 1.3.6.2, утв. приказом Роспотребнадзора от 24.12.2020 № 869).

1. Freschi L., Vincent A.T., Jeukens J. et al. The Pseudomonas aeruginosa Pan-Genome Provides New Insights on Its Population Structure, Horizontal Gene Transfer, and Pathogenicity. Genome Biol Evol. 2019;11(1):109–120. DOI: 10.1093/gbe/evy259.
2. Del Barrio-Tofiño E., López-Causapé C., Oliver A. Pseudomonas aeruginosa epidemic high-risk clones and their association with horizontally-acquired β-lactamases: 2020 update. Int J Antimicrob Agents. 2020;56(6):106196. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2020.106196.
3. Шек Е.А., Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В. и др. Антибиотикорезистентность, продукция карбапенемаз и генотипы нозокомиальных штаммов Pseudomonas aeruginosa в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН 2015–2016». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019;21(2):160–170. [Edelstein M.V., Shek E.A., Sukhorukova M.V. et al. Antimicrobial resistance, carbapenemase production and genotypes of nosocomial Pseudomonas aeruginosa isolates in Russia: results of multicenter epidemiological study «MARATHON 2015–2016». Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. 2019;21(2):160–170 (in Russ.)]. DOI: 10.36488/cmac.2019.2.147-159.
4. Склеенова Е.Ю., Азизов И.С., Шек Е.А. и др. Pseudomonas aeruginosa в РФ: история одного из наиболее успешных нозокомиальных патогенов. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2018;20(3):164–171. [Skleenova E.Yu., Azizov I.S., Shek Е.А et al. Pseudomonas aeruginosa: the history of one of the most successful nosocomial pathogens in Russian hospitals. Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. 2018;20(3):164–171 (in Russ.)].
5. Кузьменков А.Ю., Виноградова А.Г., Трушин И.В. и др. AMRmap — система мониторинга антибиотикорезистентности в России. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2021;23(2):198–204. [Kuzmenkov A.Yu, Vinogradova A.G., Trushin I.V. et al. AMRmap — antibiotic resistance surveillance system in Russia. Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. 2021;23(2):198–204 (in Russ.)]. DOI: 10.36488/cmac.2021.2.198-204.
6. Santoro A., Franceschini E., Meschiari M. et al. Epidemiology and risk factors associated with mortality in consecutive patients with bacterial bloodstream infection: impact of MDR and XDR bacteria. Open Forum Infect. Dis. 2020;7(11):ofaa461. DOI: 10.1093/ofid/ofaa461.
7. Садеева З.З., Новикова И.Е., Алябьева Н.М. Характеристика Pseudomonas aeruginosa, выделенных из положительных проб гемокультур и ликвора у детей. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022;99:309–321. [Sadeeva Z.Z., Novikova I.E., Alyabyeva N.M. et al. Characterization of Pseudomonas aeruginosa isolated from positive samples of hemocultures and cerebrospinal fluid of children. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2022;99(3):309–321 (in Russ.)]. DOI: 10.36233/0372-9311-241.
8. Zhang X., Zhu Y., Gao Y. et al. Evaluation and analysis of multidrug resistance- and hypervirulence-associated genes in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains among children in an area of China for five consecutive years. Front Microbiol. 2023;14:1280012. DOI: 10.3389/fmicb.2023.1280012.
9. Багирова Н.С., Петухова И.Н., Григорьевская З.В. и др. Проблемы устойчивости к противомикробным препаратам в онкологическом стационаре: диагностика продукции карбапенемаз, генотипы нозокомиальных штаммов A. baumannii, P. aeruginosa и K. pneumoniae. Лабораторная служба. 2020;9(4):17–25. [Bagirova N.S., Petukhova I.N., Grigoryevskaya Z.V. et al. Problems of antimicrobial resistance in cancer hospital: diagnosis of carbapenemase production, genotypes of nosocomial A. baumannii, P. aeruginosa and K. pneumoniae strains. Laboratory Service=Laboratornaya sluzhba. 2020;9(4):17–25 (in Russ.)]. DOI: 10.17116/labs2020904117.
10. Kocsis B., Gulyás D., Szabó D. Diversity and distribution of resistance markers in Pseudomonas aeruginosa international high-risk clones. Microorganisms. 2021;9(2):359. DOI: 10.3390/microorganisms9020359.
11. Bocharova Y., Savinova T., Lazareva A. et al. Genotypes, carbapenemase carriage, integron diversity and oprD alterations among carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa from Russia. Int J Antimicrob Agents. 2020;55(4):105899. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2020.105899.
12. Danel F., Hall L.M., Gur D., Livermore D.M. OXA-14, another extended-spectrum variant of OXA-10 (PSE-2) beta-lactamase from Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 1995;39:1881–1884. DOI: 10.1128/AAC.39.8.1881.
13. Greenwood B., Meunier D., Hopkins K.L. et al. Pseudomonas aeruginosa sequence type 357 with VEB extended-spectrum β-lactamases in the UK: relatedness and resistance. Int J Antimicrob Agents. 2018;52(2):301–302. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2018.03.013.
14. Aguilar-Rodea P., Zúñiga G., Cerritos R. et al. Nucleotide substitutions in the mexR, nalC and nalD regulator genes of the MexAB-OprM efflux pump are maintained in Pseudomonas aeruginosa genetic lineages. PLoS One. 2022;17(5):e0266742. DOI: 10.1371/journal.pone.0266742. eCollection 2022.