Введение
Наследственные мутации в генах BRCA1 и BRCA2 (BRCA1/2) увеличивают риск развития рака различных локализаций. Наиболее значительно — на 60–80% — возрастает риск развития одно- и двухстороннего рака молочной железы (РМЖ) и рака яичников (РЯ) — примерно на 20–50% [1, 2]. Также у носителей BRCA-мутаций повышен риск развития рака предстательной железы (РпредЖ), рака поджелудочной железы (РподЖ), желудка и других вторых первичных опухолей. В то же время определение BRCA-статуса у больных злокачественными новообразованиями (ЗНО) играет важную роль для выбора тактики хирургического лечения и профилактики, а также выявления показаний для назначения таких таргетных препаратов, как PARP-ингибиторы, поскольку опухоли, ассоциированные с BRCA-мутацией, высокочувствительны к PARP-ингибиторам и препаратам платины [3].
Интенсивные исследования мутаций в генах BRCA1/2 в российской популяции больных РМЖ и/или РЯ начались в 1996 г. В результате этих работ были идентифицированы частые мутации: в BRCA1 — c.5266dup (5382inC), c.181T>G (300T>G), c.68_69del (185delAG), c.4035delA (4154delA), c.1961del (2080delA), c.3700_3704del (3819del5), c.3755_3758del (3875del4); в BRCA2 — c.5946del (6174delT) [4–6]. Выявление повторяющихся в российской популяции мутаций позволило создать диагностическую панель для первичного генетического скрининга пациентов. Однако повторяющиеся мутации в гене BRCA1 покрывают примерно 70–80% всех мутаций [4–6], а ген BRCA2 характеризуется широким разнообразием различных мутаций, и единственная мутация c.5946del (6174delT) может быть отнесена к частым. При отсутствии у пациента с РМЖ, РЯ, РподЖ или РпредЖ частой мутации очевидна необходимость изучения полной кодирующей последовательности обоих генов, особенно при подозрении на наследственный характер заболевания.
Цель исследования: оценка результатов массового скрининга пациентов с различными типами ЗНО с использованием панели первичного генетического скрининга и полного анализа кодирующей последовательности генов BRCA1 и BRCA2.
Материал и методы
В настоящее исследование включены результаты молекулярно-генетического тестирования 5043 пациентов, проходивших лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России в период с 2018 по 2021 г. Среди обследованных было 4050 больных РМЖ, 166 — двухсторонним РМЖ (ДРМЖ), 481 — РЯ, 175 — первично-множественными злокачественными новообразованиями (ПМЗНО), одним из которых был РМЖ, РЯ или РподЖ, 96 — РподЖ, 75 — РпредЖ.
Всем пациентам было проведено молекулярно-генетическое исследование носительства частых герминальных мутаций в гене BRCA1 — c.68_69del, c.1961del, c.3700_3704del, c.3755_3758del, c.4035del, c.5266dup, р.C61G и в гене BRCA2 — c.5946del. ДНК-диагностика проводилась на образцах периферической крови методом ПЦР в реальном времени с использованием набора реагентов «ОнкоГенетика BRCA» («ДНК-технология», Россия) по инструкции производителя.
Исследование всей кодирующей нуклеотидной последовательности генов BRCA1/2 выполнено у 655 больных, из них: 379 — с РМЖ, 49 — с ДРМЖ, 101 — с РЯ, 42 — с ПМЗНО, 44 — с РподЖ и 40 — с РпредЖ. Шестьсот двадцать образцов периферической крови пациентов исследовали с использованием метода анализа кривых плавления с высоким разрешением (HRM-анализ, High Resolution Melting). Для охвата всей кодирующей области и сайтов сплайсинга генов BRCA1/2 было использовано 84 пары праймеров. ПЦР в реальном времени проводили на ПЦР-анализаторе LightCycler 480 (Roche) с использованием интеркалирующего красителя EvaGreen. Все анализируемые фрагменты, отличающиеся от нормализованной кривой плавления, верифицировали методом секвенирования по Сэнгеру на генетическом анализаторе GenomeLab GeXP (Beckman Coulter). Тридцать пять образцов были проанализированы методом массового параллельного секвенирования на генетическом анализаторе GeneReader (Quagen) с использованием панели GeneRead QIAact BRCA1/2 Panel по инструкции производителя.
Выявленные варианты генов были обозначены согласно номенклатуре, представленной в рекомендациях Human Genome Variation Society (HGVS) [7]. Использовали референсную последовательность транскриптов BRCA1 (NM_007294.3) и BRCA2 (NM_000059.3).
Для интерпретации обнаруженных вариантов использовали базы данных dbSNP (The Single Nucleotide Polymorphism database) и ClinVar (Clinical Variation). Функциональную значимость обнаруженных миссенс-вариантов оценивали с помощью программ предсказания патогенности PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer), SIFT (Sorting Intolerant from Tolerant), MutationAssessor, PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping), FATHMM (Functional Analysis through Hidden Markov Models (v2.3), использовали 2 программных алгоритма) и Align-GVGD. Популяционную частоту аллелей оценивали с помощью баз данных проектов ExAC (Exome Aggregation Consortium), 1000G (1000 Genomes Project), The PAGE Study, TOPMed (Trans-Omics for Precision Medicine).
Все нуклеотидные варианты классифицировали по их патогенности согласно рекомендациям консорциума Enigma (Evidence-based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles) [8]: класс 5 — патогенный (pathogenic); класс 4 — вероятно патогенный (likely pathogenic); класс 3 — неопределенного значения (uncertain significance); класс 2 — вероятно доброкачественный (likely benign); класс 1 — доброкачественный (benign).
Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения «Медицинская статистика» (https://medstatistic.ru/calculators). Сравнение частот в разных группах выполняли при помощи двустороннего критерия Фишера и критерия χ2 с поправкой Йетса.
Результаты и обсуждение
Клиническая характеристика исследованной группы больных представлена в таблице 1.
Первоначально 5043 пациентам была проведена ДНК-диагностика распространенных в российской популяции мутаций. Было выявлено 403 (8%) пациента с наличием частой герминальной мутации. Среди пациентов с РМЖ частота повторяющихся вариантов составила 6,7% (272 из 4050), при ДРМЖ — 13,5% (23 из 170), в группе РЯ — 17% (82 из 481), в группе ПМЗНО — 13,1% (23 из 175), при РподЖ — 3,1% (3 из 96), среди больных РпредЖ мутаций выявлено не было. Частота повторяющихся мутаций в общей группе и в группах больных с различным диагнозом приведена в таблице 2.
В настоящее время определение мутаций в генах BRCA1/2 с диагностическими и профилактическими целями приобрело в России широкое распространение. Особенностью российской популяции является значительное преобладание одной BRCA1-мутации — c.5266dup (5382delC). Эта мутация с эффектом основателя возникла 1500–1800 лет назад, вероятно, на северо-западной территории России [9]. В нашей выборке больных различными ЗНО выявлено 284 носителя c.5266dup, т. е. частота мутации составила 5,63%. Сорок девять (0,97%) пациентов являлись носителями другой характерной для славянских популяций мутации — p.C61G. Остальные варианты обнаруживались гораздо реже (0,10–0,38%). Схожие показатели встречаемости мутаций описаны в других полномасштабных российских исследованиях [10–12].
Всего же тестирование 8 частых мутаций позволило выявить 403 (8,0%) носителя мутации. Для разных ЗНО частота мутаций варьировала: от 3,1% при РподЖ и 6,7% при РМЖ до 17,0% при РЯ (РМЖ/РЯ: χ2=62,3, р<0,001). Подобные значения частот получены в российских исследованиях: среди 10 968 больных РМЖ и/или РЯ, протестированных в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, частота 4 мутаций (BRCA1: 5382insC, 4153delA, 185delAG; BRCA2: 6174delT) составила 6% [10], в ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России при исследовании 3826 больных РМЖ мутации выявлены в 3,5% случаев [11] и в 3,8% (169 носителей из 4440 обследованных) случаев [12]. Таким образом, скрининговое тестирование частых мутаций в российской популяции позволило более точно определить частоту встречаемости каждой из них, что подтверждает высокую частоту мутаций c.5266dup и p.C61G.
Отметим, что среди 329 больных ЗНО с выявленной мутацией, которые прошли медико-генетическое консультирование, 40 (12,2%) человек не имели отягощенного онкологического семейного анамнеза, 12 (3,6%) из них на момент постановки диагноза были старше 50 лет. В случае РМЖ среди 230 носителей мутации было 29 (12,6%) пациентов без семейной истории, из которых старше 50 лет было 6 (2,6%) человек. При этом в нашем исследовании к отягощенному семейному анамнезу относили случаи наличия у кровных родственников таких ЗНО, как рак тела матки, рак толстой кишки, рак желудка, лимфома и ряд других, не соответствующих классическому определению наследственного РМЖ/РЯ. То есть существует определенная и не очень малая группа больных, которые, не имея клинических признаков наследственного заболевания РМЖ/РЯ, тем не менее являются носителями патогенной BRCA-мутации.
На втором этапе исследования был проведен анализ всей кодирующей последовательности генов BRCA1/2 у 655 пациентов. Патогенные мутации (класс 5), включающие делеции, вставки, дупликации, нонсенс-мутации и мутации сайта сплайсинга, а также 4 миссенс-мутации, относящиеся к клинически значимым мутациям согласно данным ClinVar и dbSNP, были обнаружены в 85 (13%) случаях. Данные о частотах патогенных вариантов в генах BRCA1/2 в разных группах больных представлены в таблице 3.
Частота встречаемости редких вариантов в гене BRCA1 несколько выше, чем в гене BRCA2, и составляет в суммарной выборке больных 7,3% и 5,7% соответственно. Однако в случае РЯ мутации обнаружены преимущественно в гене BRCA1 (13 из 15; 86,67%). При сравнении частот встречаемости вариантов в разных генах между группами РМЖ и РЯ, а также ДРМЖ и РЯ различия статистически значимы (p<0,05, F=0,0154 и p<0,05, F=0,0163 соответственно).
В гене BRCA1 обнаружена 41 уникальная клинически значимая мутация, 4 из которых повторялись. Делеция c.1510del встретилась у 4 неродственных пациентов, миссенс-вариант p.Ser1715Arg — у 3, а c.843_846del и p.Gln563Ter повторились дважды (табл. 4).
В гене BRCA2 обнаружены 29 уникальных клинически значимых мутаций, 5 из которых повторялись. Делеция c.2808_2811del встретилась у 4 неродственных пациентов, мутация сайта сплайсинга c.9117 G>A — у 3 больных, c.2653_2656del, p.Ile2627Phe и c.9097del повторились дважды (табл. 5).
Наиболее частым типом мутаций в обоих генах были делеции, которые составили 48,8% в гене BRCA1 и 44,8% в гене BRCA2, а также нонсенс-мутации, обнаруженные в 22% и 24,1% соответственно.
Примерами фенотипического проявления редких мутаций в гене BRCA2 являются родословные семей Л. и К. В родословной семьи Л. мутация p.Leu2092Profs манифестировала у пациента с РпредЖ в молодом возрасте (46 лет), к моменту выявления мутации процесс имел распространенный характер и, несмотря на назначение олапариба, спустя 8 мес. пациент умер. Через 3 года РМЖ (тройной негативный фенотип) был диагностирован у его сестры. В процессе обследования была выявлена аналогичная мутация в гене BRCA2 и проведено комплексное лечение, включая профилактическую мастэктомию контралатеральной молочной железы с реконструкцией. В настоящее время пациентка находится под динамическим наблюдением, учитывая ее желание, планируется выполнение профилактической сальпингоовариоэктомии (рис. 1).
В родословной семьи К. редкая мутация в гене BRCA2 была выявлена у пациентки с диагнозом РподЖ. Надо отметить, что ни по возрасту манифестации (63 года), ни по семейному анамнезу пациентка не соответствовала показаниям для молекулярно-генетического тестирования генов BRCA1/2, выполненного в рамках научного исследования, в котором тестировали всех пациентов с данным диагнозом (рис. 2).
Таким образом, расширенная ДНК-диагностика генов позволила выявить 70 уникальных мутаций (41 BRCA1 и 29 BRCA2), 9 из которых повторялись у неродственных больных. Частота мутации c.1510del в гене BRCA1 и мутации c.2808_2811del в гене BRCA2 в нашей выборке составила 0,61%, что превышает частоты встречаемости 6 частых мутаций, за исключением c.5266dup и p.C61G. Мутация с.1510del (BRCA1) с частотой 0,34% (1/290) описана в работе Е.И. Новиковой и соавт. [12]. В исследованной группе больных РМЖ/РЯ в Чехии ее частота составила 0,1% (7 семей из 7400) [13], в польско-украинской выборке — 0,22% (1/460) [14]. Что касается повторяющейся мутации c.2808_2811del в BRCA2 (описывается также как c.2806_2809delAAAC), то она обнаружена в исследованиях А. Соколенко и соавт. [10] (частота 0,25%), в Чехии (частота 0,35%) [13], в польской выборке (частота 0,1%) [15]. Эта мутация встречается также в европейских популяциях и не имеет эффекта основателя, располагаясь в «горячей точке» гена (hot spot) [16]. Частоты новых повторяющихся вариантов в славянских выборках больных (при отсутствии распространенных мутаций) представлены в таблице 6.
Проведенный анализ наличия в российской популяции новых вариантов генов BRCA позволил выявить 8 мутаций, частота встречаемости которых сопоставима с частотами мутаций c.68_69del, c.1961del, c.3700_3704del, c.4035del и превышает частоту мутаций c.3755_3758del (BRCA1), c.5946del (BRCA2), составляя 0,26–0,31% (в таблице 6 выделены жирным шрифтом).
Также у 19 (2,9%) пациентов были обнаружены гетерозиготные варианты (в основном миссенс-мутации), встречающиеся c низкой частотой или незарегистрированные в общепопуляционных базах данных (табл. 7). Согласно результатам баз данных ClinVar и dbSNP большая часть этих мутаций определяется как вариант с неизвестным клиническим значением (класс 3), в ряде случаев интерпретация значимости носит противоречивый характер.
Все миссенс-мутации в генах BRCA1/2 с неизвестным клиническим значением были проанализированы с использованием 7 алгоритмов предсказания патогенности. В результате анализа 3 мутации в BRCA1 и 2 мутации в BRCA2 по большинству алгоритмов были оценены как вероятно патогенные или патогенные (класс 4–5), 5 мутаций остаются вариантами с неизвестным значением, 9 вариантов определены как клинически незначимые (табл. 8).
В работе [13] мутация p.Cys24Tyr в гене BRCA1 также отнесена к классу 4, патогенность мутации p.His2623Arg в гене BRCA2 подтверждена в ряде исследований [17, 18]. Вариант p.Glu2918Val (BRCA2) обнаружен у 32-летнего пациента с РподЖ. Нуклеотидная замена c.8753A>T затрагивает канонический сайт сплайсинга, однако оценка влияния этой замены на процесс сплайсинга в настоящее время экспериментально не проведена. Экспериментальная оценка функциональной значимости мутаций p.Ser184Phe и p.Trp1718Arg (BRCA1) в настоящее время также не проведена.
Помимо вышеперечисленных вариантов мутаций в генах BRCA1/2 были обнаружены известные частые или редкие миссенс-мутации, которые в настоящее время, согласно результатам баз данных ClinVar, BIC database и Ensembl, являются непатогенными и не имеющими клинического значения (класс 1–2) (табл. 9).
Основываясь на полученных нами данных и анализе источников литературы, посвященных аналогичной теме, мы предлагаем следующий возможный алгоритм ДНК-диагностики мутаций в генах BRCA1/2.
Первый этап: тестирование двух частых BRCA1-мутаций c.5266dupC и p.C61G у всех больных РМЖ, РЯ, ПМЗНО вне зависимости от семейного анамнеза, возраста и национальности. Мы показали, что 12–13% больных не имеют отягощенного семейного анамнеза, и больные с возрастом манифестации старше 50 лет могут быть носителями мутации. Хотя мутации c.5266dupC и p.C61G имеют славянское происхождение, они широко распространены в стране и обнаруживаются у пациентов иных национальностей. Такой тест дает возможность выявлять значительную часть носителей BRCA1-мутаций при низкой стоимости и малой трудоемкости исследования.
Второй этап: тестирование других часто встречающихся мутаций. К таким можно отнести следующие: в BRCA1— c.68_69del (185delAG), c.4035del (4154delA), c.1961del (2080delA), c.3700_3704del (3819del5), c.1510del, p.Gln563Ter, p.Arg1563Ter; в BRCA2 — c.2808_2811del, c.2653_2656del, p.Ile2627Phe, c.9117G>A (р.Pro3039Pro), p.Arg2336His. Диагностика 12 мутаций позволит выявить еще примерно 4–5% носителей, а стоимость и трудоемкость анализа также невелики.
Третий этап: поиск мутаций в генах методом массового параллельного секвенирования. Ввиду высокой в настоящее время стоимости такого исследования, в рамках ОМС показанием к его назначению служат клинические признаки наследственного заболевания.
Заключение
Таким образом, в российской популяции выявлены повторяющиеся мутации, возникновение которых в большинстве случаев связано, вероятно, с эффектом основателя. Преобладание варианта c.5266dupC в гене BRCA1 среди больных РМЖ и/или РЯ является особенностью российской популяции. Обнаружение новых повторяющихся мутаций в обоих генах может способствовать созданию расширенной диагностической панели для тестирования этих вариантов. Результаты демонстрируют, что в Российской Федерации поиск мутаций в генах BRCA1/2 может проводиться в несколько этапов, когда NGS выполняется при отсутствии у пациента мутации с эффектом основателя.
Сведения об авторах:
Строганова Анна Михайловна — к.м.н., заведующая молекулярно-биологической лабораторией ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; 115478, Россия, г. Москва, Каширское ш., д. 23; ORCID iD 0000-0002-7297-5240.
Поспехова Наталья Ивановна — д.б.н., старший научный сотрудник молекулярно-биологической лаборатории ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; 115478, Россия, г. Москва, Каширское ш., д. 23; ORCID iD 0000-0001-5255-5065.
Головина Дарья Андреевна — к.б.н., научный сотрудник молекулярно-биологической лаборатории ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; 115478, Россия, г. Москва, Каширское ш., д. 23.
Черепанова Изольда Семеновна — д.м.н., профессор, академик РАМТН, ректор НОЧУ «МИПМО»; 119415, Россия, г. Москва, ул. Лобачевского, д. 42, стр. 4.
Дранко Светлана Левоновна — врач — лабораторный генетик молекулярно-биологической лаборатории ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; 115478, Россия, г. Москва, Каширское ш., д. 23; ORCID iD 0000-0003-3315-0817.
Филиппова Маргарита Геннадьевна — к.м.н., старший научный сотрудник научно-консультативного отделения ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; 115478, Россия, г. Москва, Каширское ш., д. 23; ORCID iD 0000-0002-1883-2214.
Контактная информация: Строганова Анна Михайловна, e-mail: stroganova_am@mail.ru.
Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах.
Конфликт интересов отсутствует.
Статья поступила 15.03.2022.
Поступила после рецензирования 07.04.2022.
Принята в печать 04.05.2022.
About the authors:
Anna M. Stroganova — C. Sc. (Med.), Head of the Molecular Biology Laboratory, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology; 23, Kashirskoe road, Moscow, 115478, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-7297-5240.
Natal’ya I. Pospekhova — Dr. Sc. (Biol.), senior researcher of the Molecular Biology Laboratory, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology; 23, Kashirskoe road, Moscow, 115478, Russian Federation; ORCID iD 0000-0001-5255-5065.
Dar’ya A. Golovina — C. Sc. (Biol.), researcher of the Molecular Biology Laboratory, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology; 23, Kashirskoe road, Moscow, 115478, Russian Federation.
Izol’da S. Cherepanova — Dr. Sc. (Med.), Professor, RAMTS Academician, Rector of the International Institute of Postgraduate Medical Education; 42, Bldn. 4, Lobachevsky str., Moscow, 119415, Russian Federation.
Svetlana L. Dranko — physician — laboratory geneticist of the Molecular Biology Laboratory, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology; 23, Kashirskoe road, Moscow, 115478, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-3315-0817.
Margarita G. Filippova — C. Sc. (Med.), senior researcher of the Scientific and Advisory Department, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology; 23, Kashirskoe road, Moscow, 115478, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-1883-2214.
Contact information: Anna M. Stroganova, e-mail: stroganova_am@mail.ru.
Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned.
There is no conflict of interests.
Received 15.03.2022.
Revised 07.04.2022.
Accepted 04.05.2022.