Экспериментальные модели глаукомы в свете исследованийновых нейропротекторов

РМЖ «Клиническая Офтальмология» №3 от 21.10.2015 стр. 145-149
Рубрика: Офтальмология

Для цитирования: Алябьева Ж.Ю., Романова Т.Б., Липатова В.А., Ботчей В.М. Экспериментальные модели глаукомы в свете исследованийновых нейропротекторов // РМЖ «Клиническая Офтальмология». 2015. №3. С. 145-149
В настоящее время для моделирования глаукомы in vivo применяются различные методы химического или физического воздействия на глаз в эксперименте на животных (гипертонический раствор, адреналин, лазер и т. п.), а также используются генетически модифицированные животные (лабораторные крысы) с генами, ответственными за развитие глаукомы. Для моделирования глаукомы in vitro применяются методы, включающие апоптоз культивированных ганглиозных клеток сетчатки и астроцитов головки зрительного нерва (ЗН). Разрабатываются также и новые модели глаукомы. В сообщении представлен обзор различных вариантов экспериментальной глаукомы и способов их применения, а также освещены направления работ по перспективным группам нейропротекторов.

Ключевые слова: модель глаукомы, нейропротекция, эксперимент.

Для цитирования: Алябьева Ж.Ю., Романова Т.Б., Липатова В.А., Ботчей В.М. Экспериментальные модели глаукомы в свете исследований новых нейропротекторов // РМЖ. Клиническая офтальмология. 2015. № 3. С. 145–149.
Experimental models of glaucoma in the research of a new neuroprotection treatment
Alyabyeva Zh.Yu. 1.2, Romanova T.B. 1,
Lipatova V.A. 1, Botchei V.M. 3

1 Pirogov Russian National Research Medical University
2 Moscow Glaucoma Center (City Clinical Hospital 15)
3 Peoples’ Friendship University of Russia

For modelling of glaucoma different chemical and physical agents (hypertonic saline, adrenalin, laser and so on) are used in vivo in experimental animals as well as genetically modified animals such as rats (with the genes responsible for the development of glaucoma. Models, including apoptosis of ganglion retinal cells, astrocytes of the optic nerve head are applied for modelling glaucoma in vitro. The review presents different glaucoma models and their use as well as the directions of the research of the perspective neuroprotection medications.

Key words: glaucoma model, neuroprotection, experiment.

For citation: Alyabyeva Zh.Yu., Romanova T.B., Lipatova V.A., Botchei V.M. Experimental models of glaucoma in the research of a new neuroprotection treatment. // RMJ. Clinical ophthalomology. 2015. № 2. P. 145–149.

Статья посвящена экспериментальным моделям глаукомы в свете исследований новых нейропротекторов

В последние годы произошел взрывной рост информации о молекулярной основе апоптоза ганглиозных клеток сетчатки (ГКС), полученной в исследованиях in vitro и in vivo (на моделях острого и хронического повреждения ЗН, а также экспериментальной глаукомы). Существует множество молекулярных сигналов, запускающих апоптоз (генетически запрограммированную гибель ГКС). Причинами апоптоза ГКС могут быть: нарушение аксонального транспорта, отсутствие поступления нейротрофических факторов, токсические пронейротрофины, активация внутренних и внешних сигналов апоптоза, митохондриальная дисфункция, эксайтотоксическое повреждение, окислительный стресс, дисфункция реактивной глиальной ткани и утрата синаптических контактов.
Эти данные в значительной степени обновили и расширили представление о том, как погибают ГКС при глаукоме, а также позволили определить новые потенциальные точки воздействия для нейропротекции [1].

К перспективным мишеням нейропротекции относятся: митохондрии (коррекция митохондриальной дисфункции); нейропептид Y (NPY), экспрессируемый клетками сетчатки (при возникновении механизма глутаматной эксайтотоксичности); ингибирование RHO-киназы (улучшение оттока водянистой влаги, снижение активности фибробластов); формирование генов, замедляющих апоптоз; стволовые клетки (для поддержания функции ГКС при экспериментальной глаукоме).
Проводятся многочисленные экспериментальные исследования по изучению нейропротекторных свойств препаратов, способных влиять на основные звенья патогенеза глаукомной оптической нейропатии. Среди перспективных групп препаратов следует выделить следующие [2]:
I. Нейротрофические факторы, в частности BDNF, способны повышать устойчивость ГКС при повреждении ЗН – доказано в эксперименте, но клинических исследований не проводилось.
II. Антиапоптозные вещества.
1. Креатин, альфа-липоевая кислота, никотинамид, эпигаллокатехин галат) – противодействуют окислительному стрессу, восстанавливают функционирование митохондрий и обеспечивают нейропротекторный эффект [3].
2. Воздействие на систему нейропептидов, экспрессируемых клетками сетчатки, – NPY. Экспериментальные исследования последних лет показали роль NPY в качестве нейропротекторного фактора в отношении ткани сетчатки при возникновении механизма глутаматной эксайтотоксичности, что является перспективным в лечении глаукомной оптиконейропатии и диабетической ретинопатии [4].
III. Ингибиторы Rho-киназы.
Rho-ассоциированные киназы (Rho/Rock-путь) играют важную роль в формировании цитоскелета, синтезе компонентов внеклеточного матрикса в структурах, обеспечивающих отток внутриглазной жидкости, а также регулируют проницаемость эндотелиальных клеток шлеммова канала. Активация Rho/Rock-пути приводит к сокращению трабекулярной сети, а его ингибирование – к расслаблению трабекулы с последующим увеличением оттока водянистой влаги и снижению внутриглазного давления (ВГД). В связи с этим ингибиторы Rho-киназы рассматриваются в качестве нового перспективного класса препаратов, снижающих ВГД.

Ингибиторы Rho-киназы снижают трансдифференцировку фибробластов в миофибробласты, тем самым могут использоваться для профилактики рубцевания в области послеоперационных фильтрационных подушек.
Rho/Rock-система участвует в нейропротекции ЗН. Ее инактивация вызывает увеличение глазного кровотока, в частности кровотока сетчатки, что повышает устойчивость ГКС к патогенным воздействиям и способствует регенерации их аксонов.
Таким образом, ингибиторы Rho-киназы могут стать перспективным многофакторным средством лечения глаукомы [5].
IV. Генная терапия.
Целью данного направления исследований является разработка факторов с антиапоптозной активностью. В настоящее время этим свойством обладает Депренил – ингибитор моноаминоксидазы, увеличивающий экспрессию генов, замедляющих апоптоз, и флунаризин – фактор, замедляющий светоиндуцированный апоптоз фоторецепторных клеток.
V. Иммуномодулирующая терапия.
В эксперименте на животных было показано, что интравитреальное введение мезенхимальных стволовых клеток привело к статистически значимому увеличению общей выживаемости аксонов ГКС и уменьшению объема их потерь при экспериментальной глаукоме [6].
Для определения эффективности действия данных групп препаратов в доклинических исследованиях необходимы адекватные модели глаукомы и методы оценки степени повреждения ЗН и сетчатки. Мы ограничимся рассмотрением моделей первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ) (включая нормотензивную глаукому), составляющей порядка 90% от всех случаев первичной глаукомы.
Молекулярная основа гибели ГКС при глаукоме
Нейропротекция – лечение, направленное на замедление или предотвращение гибели нейронов для обеспечения сохранения их физиологической функции. Нейропротекция является давней, но сохраняющей свою актуальность целью клинической и фундаментальной нейронауки.
Ключевым элементом патофизиологии всех форм глаукомы является гибель ГКС – группы нейронов центральной нервной системы, тела которых находятся в сетчатке (слой ГКС), а аксоны формируют ЗН.
Находится все больше подтверждений того, что ГКС при глаукоме находятся в состоянии окислительного стресса, ассоциированного с патогенетическим механизмом, ведущим к глаукомной нейродегенерации.

Увеличение продукции активных форм кислорода, включающих ионы кислорода, свободные радикалы и перекиси как неорганического, так и органического происхождения, ведет к дегенерации ГКС, дисфункции нейроглии и активации иммунного ответа при глаукоме. Однако многие аспекты взаимосвязи окислительного стресса и нейродегенерации все еще остаются неясными. В ходе развития глаукомной нейродегенерации активные формы кислорода могут быть напрямую токсичны для ГКС либо обеспечивать вклад во вторичную дегенерацию, вызываемую дисфункцией нейроглии, а также могут функционировать как сигнальные молекулы, выполняя роль вторичного мессенджера и/или регулируя окислительно-восстановительные модификации нисходящих эффекторов [7].
Хроническое повышение ВГД приводит к прогрессирующим изменениям головки ЗН и сетчатки, меняющим устойчивость оставшихся (сохранившихся) волокон ЗН к ВГД. Для того чтобы понять природу этих прогрессирующих изменений, необходимы соответствующие патогенезу, приемлемые по цене модели экспериментальной глаукомы на животных и методы измерения полученного ВГД, а также оценки степени повреждения сетчатки и ЗН.

В головке ЗН эти повреждения включают аксональный и неаксональный эффекты, последний указывает на вовлеченность внеклеточного матрикса и реакцию астроглии. ГКС, по-видимому, претерпевают изменения, связанные с действием нейротрофинов, а также морфологические изменения, до собственно смерти клеток. Эти и другие, непознанные пока, патологические изменения ЗН и сетчатки могут вызывать снижение их толерантности к повышению ВГД и прогрессирующую оптическую нейропатию и ухудшение поля зрения даже при клинически адекватном контроле ВГД [8].

Модели глаукомы
Модели глаукомы в широком смысле могут быть подразделены на не зависящие от уровня ВГД (чистые модели ишемии/реперфузии, а также модели нормотензивной глаукомы) и те, которые основываются на повышении ВГД. Также существует разделение на модели in vitro и in vivo. Модели in vivo включают модели с индуцированной глаукомой, трансгенных животных и природные генетические линии животных с наследуемой глаукомой (в частности, порода собак – бигль).
In vitro для модели глаукомы используют:
1. Изолированные ГКС и их культуры.
2. Изолированные астроциты и их культуры.
3. Изолированные микроглиальные клетки и их культуры.
4. Изолированную сетчатку.
5. Клетки периферической крови (лимфоциты).
Методами моделирования глаукомных изменений в изолированных клетках, культурах клеток и изолированных тканях являются: повышение давления на них, введение эндотелина (экзогенное повышение концентрации ЕТ-1) и культивирование клеток с повышенной продукцией эндотелина (ET-1). В некоторых экспериментах комбинируют модели глаукомы in vitro и in vivo.
Так, в эксперименте на крысах in vivo монолатерально была смоделирована офтальмогипертензия введением гипертонического раствора в эписклеральные вены, чтобы нарушить отток водянистой влаги. Мониторинг ВГД проводили на протяжении 5 нед., затем слой ГКС изолировали методом лазерной захватывающей микродиссекции и с использованием микрочипов комплементарной ДНК определяли значительно большее количество генов с измененной экспрессией, чем если бы анализировались все слои сетчатки. Затем полученные данные сравнивались с данными по модели in vitro – культуре ГКС, подвергнутой воздействию высокого давления [9].

Модели глаукомы in vitro
Примером модели ретинальной ишемии на плоско монтированных изолированных сетчатках мышей является следующее: устойчивость ГКС к ишемии тестировалась в ходе лишения их кислорода/глюкозы (кислородно-глюкозной депривации), а также модели ретинальной ишемии/реперфузии. Смерть ГКС (уровень апоптоза) определяли, используя метку (с помощью окрашивания) аннексином V-FITC (Annexin V-FITC) и пропидиум йодидом или подсчетом β-III-тубулин иммунопозитивных нейронов в слое ГКС плоско монтированной сетчатки [10].
В большинстве моделей клеточных культур для исследования возможностей нейропротекции используют клетки сетчатки. Механизмы патогенеза, которые могут быть исследованы на культурах клеток, включают: аксонотомию и сывороточную депривацию либо депривацию факторами роста [11].

Исследования с использованием периферических тканей, в частности периферических лимфоцитов, пациентов с ПОУГ предполагают наличие системной митохондриальной дисфункции у этих больных. Изолированные лимфоциты из периферической крови с антикоагулянтами применялись для изучения процессов окислительного фосфорилирования в митохондриях пациентов с первичной ПОУГ [12].
In vitro модель гипоксии на культивированных первичных астроцитах головки человеческого ЗН применялась для изучения патогенеза глаукомы, одними из звеньев которого являются ответ на гипоксию и активация астроцитов в головке ЗН. Из изолированных головок ЗН, полученных от здоровых глаз доноров, были приготовлены экспланты и культивированы первичные клеточные линии. Было обнаружено, что для первичных человеческих астроцитов головки ЗН, активированных при гипоксии, моделирующей ишемический инсульт, пик гипоксической реакции достигается в сроки между 5 и 8 ч [13]. Также для исследования действия нейропротекторов использовали модели интактных астроцитов [14].

Модели глаукомы in vivo
Ретинальная ишемия/реперфузия является важной причиной ухудшения зрения при различной глазной патологии, такой как окклюзии сосудов сетчатки, диабетическая ретинопатия, глаукома и травма глаза.
Наглядно демонстрирует стандартные методы оценки состояния структуры (прижизненно и post mortem) и функции, применяемые в исследованиях нейропротекции при глаукоме, модель ишемии/реперфузии на канюлированных глазах мышей. Глаза самок мышей C57BL6/J были канюлированы иглой 30G, и ВГД поднимали до 120 мм рт. ст. в течение 1 ч, вызывая ишемию. Затем, вынимая иглу, обеспечивали реперфузию сетчатки. Прижизненное мониторирование сетчатки осуществляли спектральным оптическим когерентным томографом (SD OCT) на 3, 7, 14, 21 и 28-й день после ишемии/реперфузии, после чего оценивали гистологические срезы в окраске гематоксилин-эозином и подсчитывали клетки в слое ГКС. Также в ходе эксперимента проводили оценку функционального состояния сетчатки методом скотопической электроретинографии [15].
К настоящему моменту уже выявлено более 20 генетических локусов, ответственных за развитие ПОУГ, однако идентифицированы лишь 3 гена, непосредственно обусловливающих возникновение заболевания (миоциллин, оптиневрин и WDR36 или GLC1G – ген, ответственный за развитие апоптоза).
Как известно, глаукому можно индуцировать у обезьян, собак, крыс, кроликов, овец, коров, птиц. Также существуют модели на трансгенных животных: мышах, крысах и рыбах. Для трансгенных моделей глаукомы используют да́нио-ре́рио «дамский чулок» (Zebrafish) или брахиданио-рерио (лат. Danio rerio) — вид пресноводных рыб семейства карповых (лат. Cyprinidae), известный также как популярная аквариумная рыбка.

Модели глаукомы in vivo на трансгенных животных включают следующие:
A. Мыши:
I. Гипертензивная ПОУГ:
1) трансгенные мыши с мутацией миоциллинового гена;
2) трансгенные мыши, α-1 субъединица коллагена I типа.
II. Нормотензивная ПОУГ:
1) трансгенные мыши, Glast;
2) трансгенные мыши, мутация Eaac1.
Б. Крысы: Мутация «bug eye».
В. Данио-рерио:
1) трансгенные, Irp2 мутация;
2) трансгенные, wdr36 (GlC1) мутация.
Модели с индуцированной глаукомой включают нижеперечисленные:
А. Обезьяны:
I. Лазеркоагуляция всей трабекулярной сети (снижение оттока водянистой влаги периферическими передними синехиями).
II. Внутрикамерная инъекция латексных микросфер (блокада трабекулярной сети).
III. Внутрикамерная инъекция аутологичных фиксированных эритроцитов (блокада трабекулярной сети).
В. Крысы: местная аппликация преднизолона.
Г. Кролики:
I. Субконъюнктивальная инъекция бетаметазона.
II. Инъекция α-химотрипсина в заднюю камеру глаза (блокада трабекулярной сети).
Д. Овцы: местная аппликация преднизолона.
Е. Коровы: местная аппликация преднизолона.
Ж. Птицы: светоиндуцированная глаукома (снижение оттока водянистой влаги).
Наиболее отработанными моделями глаукомы in vivo, не требующими значительных финансовых ресурсов и удобными для содержания в лабораторных условиях, являются модели на грызунах (лабораторные мыши и крысы): введение гипертонического раствора в эписклеральные вены, лазеркоагуляция, термокоагуляция эписклеральных вен, а также на кроликах: адреналин-индуцированная глаукома, введение эндотелина, лазериндуцированная глаукома.

Из моделей нормотензивной глаукомы одной из наиболее простых, но учитывающей важнейшее звено патогенеза является модель на мышах (в предыдущих исследованиях – на крысах), которая заключается в хроническом введении вазоконстрикторного пептида эндотелина – ET-1 в ЗН, вызывающем снижение кровотока и гибель ГКС. В новых модификациях этой методики ишемический стресс, обусловливающий повреждение ГКС и нейроглии, обеспечивается хронической повышенной выработкой ET-1 в сетчатке. Так, взрослые C57BL/6 мыши получали интравитреальную инъекцию аденовирусного вектора с геном человеческого эндотелина вместе с аденовирусным вектором, отвечающим за экспрессию GFP (green fluorescein protein – зеленый флюоресцентный белок).
Анализ, проведенный через 6 мес. после интравитреальной инъекции, показал снижение на 37% количества ГКС в глазах, экспрессировавших ET-1, по сравнению с контрольной группой глаз, экспрессировавших GFP. Возросшая экспрессия глиального фибриллярного кислого белка, производимого мюллеровыми клетками сетчатки, предполагает стимуляцию активации глии оверэкспрессией ET-1 [16].

Из последних моделей, используемых для исследо­вания нейропротекции, интересна модель апоптоза с флюоресцентными белками (аннексин-5), разработанная M.F. Cordeiro et al., которая позволяет отслеживать развитие апоптоза in vivo, в режиме реального времени и по каждому нейрону с помощью флюоресцентных белков (аннексина-5) и лазерной сканирующей офтальмоскопии. Совершенствование экспериментальных методик продолжается множеством научных групп во всем мире [17].
В заключение хочется процитировать высказывание L.А. Levin (2001): «Необходима осторожность в переложении данных, полученных на моделях, применительно к людям, и не существует единственного универсального критерия для определения того, какая модель – in vitro или in vivo – наиболее подходит для данной клинической ситуации. Наиболее важным является корреляция результатов, полученных на модели, с результатами клинической практики, которые станут доступны лишь с течением времени, когда заканчиваются рандомизированные клинические исследования и можно оценить их результаты» [11].
Литература
1. Almasieh M., Wilson A.M., Morquette B., Cueva Vargas J.L., Di Polo A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma // Prog. Retin. Eye Res. 2012, Mar. Vol. 31 (2). P. 152–181. Epub 2011 Dec 4.
2. Егоров Е.А., Егоров А.Е., Брежнев А.Ю. Современные аспекты нейропротекторной терапии глаукомы. Методические рекомендации. М.: Апрель, 2014. 40 с. [E.A. Egorov, A.E. Egorov, A.Ju. Brezhnev. Sovremennye aspekty nejroprotektornoj terapii glaukomy// Metodicheskie rekomendacii. M.: Aprel', 2014. 40 s. (in Russian)].
3. Osborn N.N., Chidlow G., Wood J.P. Glutamate exatotoxity in glaucoma: truth or fiction? // Eye. 2006. № 1. P. 18–22.
4. Santos-Carvalho A., Elvas F., Alvaro A.R. et al. Neuropeptide Y receptors activation protects rat retinal neural cell against necrotic and apoptoptic cell death induced by glutamate // Cell Death Dis. 2013. Vol. 4 (5). P. 636.
5. Wang J., Liu X., Zhong Y. Rho/Rho-associated kinase pathway in glaucoma (Review) // Int. J. Oncol. 2013. Vol. 43 (5). P. 1357–1367.
6. Johnson T.V., Bull N.D., Hunt D.P. et al. Neuroprotective effects of intravitreal mesenchymal stem cell transplantation in experimental glaucoma // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2010. Vol. 51 (4). P. 2051–2059.
7. Bouhenni R., Dunmire J., Sewell A., Edward D.P. Animal Models of Glaucoma // J. Biomed. Biotechnol. 2012. Vol. 2012. Article ID692609, 11 pages doi:10.1155/2012/692609.
8. Morrison J.C., Johnson E.C., Cepurna W., Jia L. Understanding mechanisms of pressure-induced optic nerve damage // Prog. Retin. Eye. Res. 2005, Mar. Vol. 24 (2). P. 217–240.
9. Guo Y., Johnson E.C., Cepurna W.O. et al. Gene Expression Changes in the Retinal Ganglion Cell Layer of a Rat Glaucoma Model // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2011, Mar. Vol. 52 (3). P. 1460–1473. Published online 2011 Mar 17. doi: 10.1167/iovs.10-5930&.
10. Shestopalov V.I., Sagdullaev B.T., Dvoriantchikova G., Yee C., Slepak V.Z. Ganglion cell loss induced by pannexin1 channel activation in retinal ischemia// ISER 2012. Program Number: 313.
11. Levin L.A. Animal and culture models of glaucoma for studying neuroprotection // Eur. J. Ophthalmol. 2001 (Jul-Sep). Vol. 11. Suppl 2. Р. 23–29.
12. Trounce I., Van Bergen N., Lee S., Sheck L., Vincent A., O'Hare F., O'Neill E., Crowston J. Mitochondrialdamage in glaucoma // ISER 2012 , O064.
13. Chan1 D.W., Sivak J.M., Flanagan J.G. Time Course of Hypoxia Response in Primary Human Optic Nerve Head // ISER. 2012. Program Number: 3862.
14. Jou M.J. Pathophysiological and pharmacological implications of mitochondria-targeted reactive oxygen species generation in astrocytes // Adv. Drug Deliv. Rev. 2008 (Oct-Nov). Vol. 60 (13-14). P. 1512–1526. Epub 2008 Jul 5.
15. Kim B.-J., Wordinger R. J., Clark A. F. Pathologic Progression Of Retinal Ischemia And Reperfusion Injury In Mice Associated With Defective Retinal Function // ISER 2012. Program Number: 2477.
16. Livne-Bar I., Guo X., Sivak J. M. Establishing a New Mouse Glaucoma Model // ISER 2012. Program Number: 2485.
17. Cordeiro M.F., Guo L., Luong V, et al. Real-time imaging of single nerve cell apoptosis in retinal neurodegeneration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004, Sep 7. Vol. 101 (36). P. 13352–13356. Epub 2004 Aug 30.

Оцените статью


Поделитесь статьей в социальных сетях

Порекомендуйте статью вашим коллегам

Предыдущая статья
Следующая статья

Авторизируйтесь или зарегистрируйтесь на сайте для того чтобы оставить комментарий.

зарегистрироваться авторизоваться
Наши партнеры
Boehringer
Jonson&Jonson
Verteks
Valeant
Teva
Takeda
Soteks
Shtada
Servier
Sanofi
Sandoz
Pharmstandart
Pfizer
 OTC Pharm
Lilly
KRKA
Ipsen
Gerofarm
Gedeon Rihter
Farmak